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Jun 05, 2023

中皮腫治療におけるホウ素中性子捕捉療法用の新しい pH 感受性治療用 PLGA ナノ粒子

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 620 (2023) この記事を引用

782 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

この研究は、中皮腫治療のためのホウ素中性子捕捉療法に基づく革新的な画像誘導アプローチを用いて、ポリ乳酸-グリコール酸共役(PLGA)ナノ粒子を開発することを目的としています。 本明細書で報告された結果は、オリゴヒスチジン鎖とデュアルGd/B治療薬AT101を組み込んだPLGAナノ粒子を利用して、ICPで評価した健康な中皮細胞よりも有意に高い治療用量のホウ素を中皮腫細胞に送達できることを実証している。 MSとMRI。 選択的放出は、腫瘍細胞外環境の弱酸性 pH を利用して pH 応答性であり、ヒスチジンのイミダゾール基のプロトン化によって引き起こされます。 熱中性子を照射した後、腫瘍細胞と健康な細胞の生存およびクローン形成能力が評価されました。 得られた結果は非常に有望であると思われ、この希少疾患に罹患している患者にPLGAナノ粒子を活用した改善された治療選択肢を提供します。

悪性中皮腫 (MM) は予後不良の進行性腫瘍であり、その発生率と死亡率は 30 ～ 50 年の潜伏期間を経た後でも過去のアスベスト曝露の関数です。 MM は有効な治療法のない稀な職業病として認識されており、診断後の生存期間中央値は 9 ～ 12 か月未満です 1,2。 MM は胸膜全体または腹膜内に広がる播種性腫瘍です。 従来の放射線療法は、いくつかの放射線感受性組織により有効性が限られており、悪性結節に照射できる最大線量が制限されています。 現在、標的療法はがん研究の主要な焦点の 1 つとなっており、がん治療における将来の多くの進歩はこのアプローチから得られると期待されています。 しかし、MM に対する分子標的に基づく効果的な治療法はまだ存在していません。 基本的に、正確なMMバイオマーカーに関する知識が不足しているため、臨床医にとってMMの早期診断を行うことは依然として課題です。 血液および胸水中の適切なバイオマーカーを見つけることを目的とした数多くの研究にもかかわらず、これらの取り組みはまだ有効な診断ツールを生み出していません3,4。 したがって、標準的な治療オプションは依然として侵襲的生検とそれに続くベバシズマブ5の有無にかかわらずシスプラチンとペメトレキセドによる化学療法であり、多くの副作用と低い有効性を伴います。 これに関連して、ポリマーナノ粒子は、中皮腫がん細胞に薬物や造影剤を送達し、治療効果と診断効果を向上させ、オフターゲット毒性を軽減するための優れた選択肢となる可能性があります6。 ナノ粒子は、局所的に増強された透過性および保持効果により、腫瘍部位で特異的に薬物を放出することができます。 さまざまな生分解性ポリマーの中でも、最近大きな注目を集めているポリ乳酸-グリコール酸共重合体ナノ粒子 (PLGA-NP) が、がん治療用の送達剤として提案されています 7、8、9、10。 米国 FDA が承認した薬物送達システムの中で、PLGA は、その制御放出特性、持続放出特性、低毒性、組織および細胞との生体適合性により、最も効果的な生分解性ポリマーの一部です。 この論文では、PLGA-NP に、Gd ベースの磁気共鳴画像法 (MRI) 造影剤と中性子捕捉療法 (NCT) に使用されるカルボラン部分 (ホウ素原子を含む正二十面体の親油性クラスター) を担持する二重治療診断用化合物をロードしました。 。 NCT は、腫瘍選択的な細胞死をもたらす、優れた有効性と低毒性を備えた標的療法の一例です 11、12、13。 より具体的には、この治療法は、低エネルギー熱中性子照射と、標的となる病理学的組織におけるホウ素含有薬剤の存在とを組み合わせることができる。 中性子は非放射性 10B によって捕捉され、崩壊核反応を引き起こしてアルファ粒子と 7Li を放出し、哺乳類細胞の平均直径よりも小さい直径約 10 μm で大きな生物学的損傷を引き起こします。 したがって、NCTはホウ素を投与し、疾患のある細胞に選択的にアルファ線を生成することで、周囲の健康な組織を温存しながら病的な細胞を殺すことができます。 これらの特徴により、BNCT は、従来の放射線療法や手術など、局所的な腫瘍塊に通常適用される方法では治療できない、または耐性がある中皮腫などのびまん性転移および浸潤性腫瘍に対する有望な治療法となります 14。 BNCTは皮膚黒色腫、脳、頭頸部腫瘍に適用されており、日本、米国、オランダ、スウェーデン、フィンランド、アルゼンチンで実施されたさまざまな臨床試験（I/II相）を通じて大量の臨床データが収集されています。 、台湾15、16。 ナカムラらは最近、前臨床マウスモデルのMMに特異的に送達されるメルカプトウンデカヒドロクロソドデカホウ酸ナトリウム（BSH）を含むヒアルロン酸を開発した17。 さらに、2006 年には、日本で少数の MM 患者が BNCT で安全に治療され、症状の大幅な緩和が達成されました 18。 ただし、BNCT の有効性を達成するには、ホウ素担体は次のさまざまな条件を考慮する必要があります。(i) 全身毒性が低い。 (ii) 腫瘍細胞に対する高い選択性。 (iii) 治療期間中の腫瘍内での長い半減期。 許容可能な照射時間と適切な中性子源を使用して効果的な治療を達成するには、腫瘍質量 1 グラムあたり約 10 ～ 30 μg の B が必要であると推定されています 19。 現在臨床試験で使用されている 2 つの化合物は、p-ボロノ-1-フェニルアラニン (BPA) (神経膠芽腫、頭頸部がん、黒色腫の治験で使用) と BSH (脳腫瘍治療用に設計) です。 これらの薬剤は腫瘍と正常組織のホウ素濃度比を 3 ～ 6 にし、安全で非常に効果的な治療を可能にします。 しかし、腫瘍細胞の標的化における取り込みがさらに改善されれば、BNCT のより広範な臨床応用が可能になるだろうという意見が科学界で広く広まっています 19。 ターゲティング戦略の成功例として、AT101 を搭載した低密度リポタンパク質 (LDL) が、黒色腫 20、肺乳房転移 21 などのさまざまな種類の腫瘍にホウ素を特異的に送達するための内因性脂質キャリアとして私たちのグループによって提案されています。中皮腫22． AT101 (スキーム 1) は、Gd ベースの造影剤で官能化されたカルボラン部分を含む二剤です。 ホウ素誘導体の中で、カルボランは、ホウ素含有量が高い (B 原子 10 個) こと、および生体内での高い安定性と組み合わされた化学的多用途性の両方で特別な位置を占めています 23、24、25、26。

PLGA-His ナノ粒子の概略図。

この研究では、15 個のヒスチジン (His) 残基 (CGGH15βA) からなる独自のアミノ酸配列で機能化された PLGA ナノ粒子、すなわち PLGA-His が、腫瘍微小環境の近くで B 含有物質を制御放出するために開発されました。 pH誘発メカニズム。 実際、オリゴマー型のヒスチジンの pKa は約 6.827 であるため、pH 7 未満ではイミダゾール環がプロトン化されます。 これは、オリゴ-His が PLGA ポリマー鎖に結合して安定したナノ粒子を形成する場合にも発生します 28。 これは、1.39 MHz で四重極緩和増強 (四極ピーク、QP とも呼ばれる) を引き起こすヒスチジンの 14 N 原子の存在によって実証され、高速フィールド サイクリング NMR リラクゼーションメーターを使用して十分に検出可能です 28。 緩和の増強は 6.5 ～ 7.5 の範囲で pH に依存するため、ナノ粒子または足場の完全性のレポーターとして機能します 28,29。 がん微小環境では pH が変化し、生理的 pH よりも酸性になることが実証されているため、本明細書では、細胞膜と選択的に相互作用してカプセル化薬物を放出する pH 感受性ナノ粒子を含むこれらの B および Gd の使用を提案します。腫瘍組織の近接。 pH 応答性ドキソルビシン送達のためのポリヒスチジン結合ポリマーハイブリッド材料の使用は、すでに文献で報告されています 31,32。 さらに、この研究では、BNCT による選択的中皮腫治療に、pH によって引き起こされる B および Gd 含有治療効果 NP の選択的送達が使用されました。 Gd ベースの MRI レポーター 33 の存在により、中性子照射前および中性子照射中における標的部位のホウ素の間接的な定量測定が可能になります 33、34、35、36。 このアプローチは、MM に罹患した患者にとって新たな治療戦略を切り開き、生存期間と生活の質の点でより良い治療結果につながる可能性があります。

PLGA Resomer® RG 502 H、Mowiol 4–88 (ポリ(ビニルアルコール)、Mw ~ 31,000)、DSPE-PEG(2000) メトキシ(1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N[メトキシ(ポリエチレン)グリコール)-2000] および他のすべての化学物質および溶媒は、Merk Life Science Srl (イタリア、ミラノ) から購入しました。

Oligo-His-PLGA は、以前に報告された手順 28 に従って調製されました。 簡単に説明すると、ペプチド配列 CGGH15βA を自動固相ペプチド合成によって構築し、PLGA Resomer® RG 502 H およびマレイミド-PEG2-NH2 から社内で調製した PLGA-PEG2-Mal に結合させました。 10B 富化 AT101 (10B 富化リガンド-C-[N-(DOTAMA-C6)-カルバモイルメチル]C'-パルミタミドメチル-o-カルボラン) は、以前に報告された手順 37 に従って調製されました。

PLGA NP は、o/w エマルジョン法に従って得られました 38。 有機相は、12.5 mgのPLGA Resomer® RG 502 H、12.5 mgのOligo-His-PLGA、2.2 mgのDSPE-PEG(2000)メトキシおよび3 mgのAT101を0.5 mlの3:1( v/v) クロロホルム – メタノール。 ＰＬＧＡ－ＣＴＲＬは、オリゴ－ヒスチジン結合リソマーの一部を含まずに、２５ｍｇのＰＬＧＡ ＲＧ ５０２Ｈを溶解することにより、同じ手順に従って作製した。 水相は、3% (w/v) Mowiol 4-88 水溶液 3 ml から構成されていました。 有機PLGA溶液をPVA溶液と一滴ずつ混合し、直ちに4℃で1分間、100%超音波処理出力で4回超音波処理しました。 有機相を、５００ｍｌのガラス製丸底フラスコ内で２時間ロータリーエバポレーションにより除去した。 蒸発後、2 L の等張 NaCl/Hepes 緩衝液 (HBS) 中で 4 °C で透析 (分子量カットオフ 14,000 Da) して、捕捉されなかった薬物を除去しました。 過剰な PVA は、vivaspin 20 フィルター (Sartorius AG、ドイツ、ゲッティンゲン、カットオフ 1 × 106 Da) で NPs 溶液を洗浄することによって除去され、洗浄ステップの最後に、最終容量 3 mL になりました。検討したすべてのナノ粒子懸濁液について達成されました。 PLGA ナノ粒子に組み込まれた Gd および B の量は、濃 HNO3 (70%、0.4 mL) でサンプルを消化した後、誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS; element-2; Thermo-Finnigan, Rodano (MI), Italy) によって測定されました。マイクロ波分解システム (ETHOS UP Milestone、ベルガモ、イタリア) で 150 °C で 8 分間加熱します。 Gd の量は、石化錯体溶液 (6 M HCl 中、120 °C、16 時間) の 21.5 MHz、25 °C (Stelar Spinmaster、Mede、イタリア) での 1 H 核磁気共鳴 R1 測定によって二重チェックされました。 ナノ粒子の水和平均直径およびＺ電位は、動的光散乱（ＤＬＳ）Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａ ｓｉｚｅｒ ３０００ＨＳを使用して測定した。 (Malvern、英国) ナノ粒子は、さらなる分析まで 4 °C の暗所で保管されました。

PLGA-CTRL および PLGA-His NP の安定性は、14 KDa 膜での透析下、37 °C、pH 6.0 または 7.4 の NaCl/Hepes バッファー 40 mL で両方の NP をインキュベートすることによって実行され、その縦緩和速度 (R1 obs) ) は、21.5 MHz、25 °C で 3、6、24、48、および 72 時間後に測定されました。

AB22 マウス中皮腫および MeT-5A ヒト健康中皮細胞株は、それぞれ Sigma および ATCC から購入しました。 AB22 細胞は 25 mM Hepes、10% FBS、1% P/S、および 2 mM グルタミンを補充した RPMI 培地で培養しましたが、MeT-5A は 10% FBS、1% P/S、8.7 を補充した培地 199 で培養しました。 E-4 mM のウシ インスリン、3.3E-6 mM のヒト EGF、4E-4 mM のヒドロコルチゾンおよび微量元素 B (Corning) を添加し、37 °C の 5% CO2 インキュベーター内で維持しました。

5 × 105 個の AB22 および MeT-5A 細胞を直径 6 cm のペトリ皿に播種し、コンフルエントの 80% に達するまで維持しました。 続いて、Gd 含有 PLGA-CTRL および PLGA-His ナノ粒子の濃度を増加させて、37 °C で 24 時間インキュベートしました。 インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン／ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）の溶液で剥離した。 次いで、細胞ペレットを０．２ｍｌのＰＢＳに再懸濁し、氷中で超音波処理（３０％出力、３０秒）し、以前に報告された手順に従って石化した。 各サンプルの細胞タンパク質は、市販の Bradford アッセイ (Biorad) を使用して定量されました。 ICP-MSによって測定された、各細胞サンプルによって取り込まれたGdおよびBのナノモルは、総細胞数に対して正規化されました。 細胞数は、検量線: [(mg タンパク質)/(細胞数)] を使用して、ブラッドフォード アッセイによって測定された細胞タンパク質の mg から得られました。 このキャリブレーションから、100 万個の AB22 と MeT-5A はそれぞれ 0.606 mg と 0.435 mg のタンパク質に相当します。 ICP-MS データから、約 100 グラムの濃度を仮定することでホウ素 ppm を計算することができました。 上皮腫瘍（直径 15 ～ 20 µm の範囲）の場合、cm3 あたり 108 細胞 38。

T1 強調画像: 未処理または NP (0.0974 mM [Gd]) で処理した AB22 および MeT-5A の細胞ペレットを含むガラス毛細管を寒天ファントム内に置き、Bruker Avance Neo 300 MHz 分光計 (7 T) を使用して MRI によって取得しました。 Micro 2.5 マイクロイメージング プローブ (BrukerBioSpin、エットリンゲン、ドイツ) を使用して。 T1W 画像は、次のパラメータを備えた標準 MSME (マルチスライス マルチエコー) シーケンスを使用して取得されました: TR = 250 ミリ秒、TE = 3 ミリ秒、FOV = 12 × 12 mm、スライス厚 = 1 mm、NEX = 6、マトリックスサイズは128×128。

AB22 および MeT-5A の T25 フラスコを、PLGA-CTRL および PLGA-His NP (97 μM [Gd] および 970 μM [B]) の存在下で 24 時間処理しました。 インキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、培地を交換した。 処理したフラスコおよび未処理の対照細胞を含むフラスコを、イタリアのパヴィア大学のTRIGA Mark II反応器のサーマルカラム内で30kWの反応器出力で15分間照射した。 照射終了後、培地を除去し、新しい培地と交換し、フラスコを 5% CO2 の加湿雰囲気下、37 °C でさらに 24 時間放置しました。 翌日、未処理フラスコと処理済みフラスコをトリプシン/EDTAで分離し、トリパンブルー排除アッセイを実施した。 照射された未処理および処理された細胞の生存率を、照射されていない細胞と比較しました。 各条件の生存細胞のパーセンテージは、未処理で照射されていない細胞の数を生存率 100% に設定することによって計算されました。

照射および非照射処理細胞および未処理細胞のクローン原性アッセイを、それぞれ異なるフラスコから約200個の細胞を直径6cmの培養皿に播種して実施した。 細胞の増殖を 18 日間追跡しました。 2 ～ 3 日後に培地を更新しました。 １８日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノール中で固定し（２５分）、２０％エタノール中の０．５％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットで染色した（３０分）。 クリスタルバイオレットを注意深く取り出し、水道水ですすいだ。 最後に、コロニーの数をImageJソフトウェアによって計算した。 %は、照射された対照細胞を100%に設定することによって計算されました。

PLGA とオリゴ His の結合（Oligo-His-PLGA）は、PLGA-PEG2-マレイミドと N 末端システインを含むオリゴ His との間のチオール-マイケル付加反応に基づいて、すでに報告されている手順 28 に従って実行されました。残基（アミノ酸配列：CGGHnβA、n = 15）。 PLGA-NP は、市販の PLGA (分子量 = 7 ～ 17 kDa; PLGA-CTRL と命名) 100% を使用するか、この PLGA の 50% と Oligo-His- PLGA (PLGA-His)。 治療薬 AT101 (スキーム 1) は、PLGA ポリマーを含む有機相に添加することによって NP にロードされました。 透析後、非常に良好な収率（> 82%）でカプセル化されたままの AT101 の量は、ICP-MS で B と Gd の両方を測定することによって決定されました。 PLGA ナノ粒子の平均流体力学的直径、ナノ粒子のミリモル緩和率、および平均表面電位を表 1 に示します。

両方の NP で観察される低くわずかに負の Z 電位は、PVA および DSPE-PEG コーティングの両方によって引き起こされる PLGA の負電荷のシールド効果によるものです 39,40。 同じ理由で、pH < 6.5 の PLGA-His では Z 電位のわずかな増加のみが測定されました。 さらに、プロトン化されたオリゴ-His の一部が粒子コア内に残る可能性があるため、測定された Z ポテンシャルへの寄与が減少します (表 1)。 ナノ粒子は 4 °C で保存され、そのサイズは 15 日ごとに DLS によって測定されました。 結果を表 2 に示します。

緩和度 (r1p) は造影剤の効率を表し、Gd 錯体溶液の mM 濃度に正規化された縦緩和速度に対する常磁性の寄与に対応します。 PLGA-CTRL と PLGA-His はどちらも、臨床的に使用されている Gd-CTRL で観察された値と比較して、4 ～ 5 倍高い r1p 値 (21.5 MHz、25 °C で約 18 s-1 mM-1、表 1) を示します。ベースの造影剤（4 ～ 5 mM-1 s-1 の範囲）41。 これは、NP にロードされたときに AT101 複合体によって満たされる長いタンブリング時間を示しており、感度の向上により、NP に取り込まれたときにこれらのイメージング プローブの検出限界が低下します。 送達システムの 37 °C での安定性は、生理食塩水緩衝液 (Hepes-NaCl 緩衝液) 中で生理学的 pH と腫瘍 pH の両方で PLGA-NP 溶液の緩和速度を 72 時間モニタリングすることによって評価されました。 この目的のために、PLGA-CTRLおよびPLGA-Hisを含む溶液を、透析下(カットオフ14KDa)、37℃、両方ともpH7.4および6.0で72時間撹拌した。 透析膜内の PLGA 溶液の緩和速度を、3、6、24、48、および 72 時間のインキュベーション後に測定しました。 図 1 は、PLGA-CTRL がこれらの条件で 72 時間本質的に安定であることを示していますが、PLGA-His の場合、酸性 pH でインキュベートすると、プロトン化により R1 (s-1) の増加が観察されました。 NP にイミダゾール基が存在し、その結果として物理化学的構造が変化して NP が膨潤し、水の浸透が促進されます。 NP の膨潤は、pH = 6.0、37 °C で 24 時間インキュベートした後、PLGA-CTRL と PLGA-His の両方のサイズを測定することによって確認されました。 実際、PLGA-CTRL で測定された流体力学的直径はほとんど変化しなかった (149.0 ± 4 nm) にもかかわらず、pH 6.0 での PLGA-His の測定された直径 (160.4 ± 3.2 nm) は約 12% 増加したため、ナノ粒子の膨潤とナノ粒子の増加が確認されました。音量。 さらに、冒頭で報告したように、オリゴヒスチジン鎖は、オリゴマー鎖に存在するイミダゾール基の 14N 核四重極共鳴周波数に起因して、1.38 MHz で特徴的な緩和ピークを示し、バックグラウンド組織によって生成された QP とはよく異なります。 14N 四重極緩和ピークは固定化システムでのみ観察される可能性があるため、イミダゾール QP の強度の変化は、ポリ His の固体/液体状態の物理的状態および微小環境の pH に関連する膨潤のレポーターとして機能する可能性があります。 参考文献 28 では、ヒスチジンのイミダゾール基のプロトン化 (pKa = 6.8) により、粒子の膨潤とポリマーの溶解度が増加し、その結果として移動度が増加し、pH < 6.0 で QP が徐々に消失することが示されました。 残念ながら、負荷された常磁性Gd錯体が緩和速度を劇的に増加させ、主要な緩和プロセスとなるため、この研究で使用したPLGA-HisではQPは検出できませんでした。

pH = 7.4（○）およびpH = 6（黒丸）のPLGA-CTRL、またはpH = 7.4（白四角）およびpH = 6（黒四角）。

この仮説を確認するために、pH 7.4 と 6 の両方で 37 °C で 0、24、および 72 時間インキュベートした後、透析膜内の溶液 (緩衝液で 1:1 に希釈) の Gd 濃度を測定しました。結果は次のとおりです。表３は、ｐＨ６でのみ、２４時間および７２時間のインキュベーション後に有意なＡＴ１０１放出が観察されたことを示しており、したがって、このｐＨでのナノ粒子の安定性の低下が確認された。

取り込み研究は、AB22 マウス中皮腫、および対照として MeT-5A ヒト健康中皮細胞株をそれぞれ使用して実施されました。 2 つの細胞株を、PLGA-His および PLGA-CTRL の両方の Gd 濃度を増加させながら 24 時間インキュベートし、24 時間後に内部移行した Gd および B の量を ICP-MS で測定し、総細胞タンパク質に対して正規化しました。 図 2 は、AB22 腫瘍細胞によるナノ粒子の取り込みが、健康な中皮 MeT-5A 細胞株と比較して全体的に増加しているようであることを示しています。 さらに、オリゴ-His でコーティングされたナノ粒子の取り込みは、複合化されていないナノ粒子と比較して、中皮腫細胞株 AB22 においてさらに強化されているようです。 結論として、PLGA-His 中のヒスチジンの存在は、健康な細胞における NP の取り込みに影響を及ぼさず、悪性細胞でのみ発生する特定の pH 誘発機構を示唆しており、これらの NP がこの悪性度の高いタイプの腫瘍細胞を特異的に標的とするのに適していることを示唆しています。

取り込み研究では、PLGA-CTRL および PLGA-His の Gd 濃度を増加させながら、AB22 および MeT-5A 上で 37 °C、5% CO2 で 24 時間インキュベートしました。

ICP-MS 分析によって得られたデータから、タンパク質の mg を細胞数に換算し（タンパク質 1 mg は、AB22 および MeT-5A ではそれぞれ 170 万個と 630 万個の細胞に相当します）、上皮腫瘍の場合は次のように仮定します（直径は15〜20μmの範囲）、密度は約10μmです。 cm3 の細胞 108 個は、これらの腫瘍組織にとって妥当な数であり 42、表 4 に報告されているように、細胞内に取り込まれた B の最大 ppm を計算することができました。

続いて、内部移行した AT101 の濃度が検出可能な MRI 信号強度増強の生成に十分であるかどうかを評価するために、PLGA-CTRL または PLGA-His とインキュベートした AB22 細胞および MeT-5A 細胞で T1 強調画像を取得しました。 ０．０９７ｍＭ（Ｇｄ濃度）で洗浄し、洗浄後、ガラスキャピラリーの底で細胞を遠心分離する。 図3で観察できるように、ナノ粒子の取り込みは以前の発見と一致しており、健康な細胞と比較して、またPLGA-CTRLとインキュベートした細胞と比較して、中皮腫細胞におけるPLGA-Hisの取り込みが増加していることを示唆しています。

PLGA-CTRL (3 および 6)、PLGA-His (2 および 5)、および未処理のコントロール細胞 (1 および 4) とインキュベートした AB22 および MeT-5A 細胞ペレットを含むガラス毛細管の T1w MRI 画像。

AT101をカプセル化したPLGAナノ粒子とともにインキュベートした細胞に、パビア大学のTriga Mark II原子炉で熱中性子を照射した。 この一連の実験では、AB22 細胞と MeT-5A 細胞を 3 つの異なる条件で 24 時間プレインキュベートしました：（1）培地のみ（CTRL 細胞）、（2）PLGA-CTRL および（3）PLGA-His を使用。 PLGA-NPを、細胞培地中の0.097 mM Gd濃度に対応する濃度でインキュベートした。 細胞は、30kWの反応器出力でサーマルカラムで15分間照射された。 図 4A に示すように、BNCT の強い細胞傷害効果が AB22 細胞で明らかに検出され、照射後 24 時間で細胞数が大幅に減少しました。 実際、照射後、照射対照群と比較して、PLGA-CTRLで処理したAB22細胞の30%が死滅し、PLGA-Hisに関してはその割合が60%に増加した。 反対に、MeT-5A 細胞は照射後 24 時間でも有意な減少を示さず、これはこの細胞型の NP の取り込みが低いことと一致しています (図 2 および表 2 に示すように)。 この観察は、照射後 18 日目に実施したクローン原性アッセイで得られた結果によって裏付けられています。 実際、図４Ｂは、特にＰＬＧＡ－Ｈｉｓで処理した場合、照射後のＡＢ２２がコロニーの形成を停止することを示している。 これらの結果は、PLGA NPで治療した場合、中皮腫細胞の再付着能力が大幅に低下することを示唆しており、特にPLGA-His投与の場合に効果的である。 反対に、MeT-5A 健康細胞は、照射された未処理の対照細胞と比較して、コロニー形成のわずかな減少のみを示します。

(A) 中性子照射から 24 時間後の正規化細胞数。PLGA-CTRL または PLGA-His で事前に処理した AB22 および MeT-5A に対して実行し、未処理の細胞と比較しました。 統計的有意性は、Student T 検定によって決定されました (***P < 0.01)。 (B) 中性子照射の 18 日後に行われたクローン原性アッセイ。 コロニーの数はImageJソフトウェアによって計算されました。 %は、照射された対照細胞を100%に設定することによって計算されました。

中皮腫は、アスベストへの曝露に関連する進行性のがんです。 アスベストはいくつかの国で禁止されているが、中皮腫の流行はアスベストの大量消費により、今世紀中に中所得国に影響を与えると予測されている。 従来の化学療法ではこのがんサブタイプに効果的に影響を与えて根絶することができないため、重要で効果的な治療法が存在しないため、この疾患に罹患した患者の予後は不良となることがよくあります43。 最近の研究により、遺伝的および病態生理学的な脆弱性が特定され、治療の大きな可能性が発見されましたが、中皮腫は依然として生存率が最も低い癌の 1 つです。 したがって、この論文では、PLGA ナノ粒子によって送達される治療効果のある化合物を使用した、ホウ素中性子捕捉療法に基づく革新的なアプローチの可能性を実証する必要があります。 私たちは、治療効果のある化合物 AT101 を効果的に保持し、腫瘍細胞に特異的に送達することができる、ポリヒスチジン鎖を含む PLGA ナノ粒子を開発し、特性評価しました。これにより、この事前標的放射線療法を最大限に活用することができます。 この論文では、これらのナノ粒子が健康な中皮細胞よりも中皮腫にどのように優先的に取り込まれるかを実証し、この恐ろしい病気の治癒における標的治療アプローチの可能性を示唆しています。 その結果、AB22中皮腫細胞は中性子照射により強い影響を受け、不可逆的な損傷を引き起こしましたが、クローン原性アッセイでも実証されたように、健康な細胞の高い割合は同じ治療で免れました。 したがって、我々は中皮腫を治療するための可能な代替治療戦略としてBNCTを提案します。

現在の研究中に使用および分析されたデータセットは、リクエストに応じて共有されます。 リクエストは対応する著者に宛ててください。

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これらの結果につながる研究は、IG 2019—ID に基づいて AIRC から資金提供を受けています。 23267 プロジェクト (PI Geninatti Crich Simonetta) およびイタリア国立核物理研究所プロジェクト: Enter_BNCT とイタリア大学研究省 (MUR) による Euro-BioImaging マルチモーダル分子イメージング イタリア ノード (MMMI) への年間 FOE 資金提供。

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ヤコポ・スフォルツィ、ディエゴ・アルベルティ、ヴァレリア・ビトント、シモネッタ・ジェニナッティ・クリッチ

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レイチェル・ステファニー

パヴィア大学物理学科、Via Agostino Bassi 6、27100、パヴィア、イタリア

ニコレッタ・プロッティ & サヴェリオ・アルティエリ

国立核物理研究所 (INFN)、パヴィア単位、Via Agostino Bassi 6、27100、パヴィア、イタリア

ニコレッタ・プロッティ & サヴェリオ・アルティエリ

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概念化: SGC、AD、JS。 方法論: SGC、AD、JS、DA、SA; 調査：JS、DA、AL、PR、SP、RS、NP、BV。 分析: JS、DA、VB、AL 執筆 - 原案: SGC、JS、DA; 執筆 - レビューおよび編集: AD、PR、AL、SP、SGC、SA、NP。 資金調達：SGC、AD、SA、NP

アンナマリア・デアゴスティーノまたはシモネッタ・ジェニナッティ・クリッチへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

スフォルツィ、J.、ランフランコ、A.、ステファニア、R. 他。 中皮腫治療におけるホウ素中性子捕捉療法用の新しい pH 感受性治療用 PLGA ナノ粒子。 Sci Rep 13、620 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-27625-0

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受信日: 2022 年 11 月 13 日

受理日: 2023 年 1 月 4 日

公開日: 2023 年 1 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-27625-0

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