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Dec 05, 2023

自閉症の削除

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 593 (2023) この記事を引用

324 アクセス

7 オルトメトリック

メトリクスの詳細

CHD8 はクロモドメイン ヘリカーゼ DNA 結合タンパク質 8 をコードしており、その変異は自閉症スペクトラム障害 (ASD) の浸透度の高い危険因子です。 CHD8 は、クロマチン再構築活性に基づいて重要な転写調節因子として機能し、それによって神経前駆細胞の増殖と分化を制御します。 しかし、有糸分裂後ニューロンおよび成人の脳における CHD8 の機能は不明のままです。 今回我々は、マウス分裂終了ニューロンにおけるChd8ホモ接合性欠失により、ニューロン遺伝子の発現が下方制御され、さらにKCl媒介ニューロンの脱分極によって誘導される活性依存性遺伝子の発現が変化することを示す。 さらに、成体マウスにおけるCHD8のホモ接合性の除去は、カイニン酸誘発発作に対する海馬における活性依存性の転写反応の減弱と関連していた。 我々の発見は、有糸分裂後ニューロンおよび成人の脳における転写制御にCHD8が関与していることを示唆しており、この機能の破壊がCHD8ハプロ不全に関連するASDの発症に寄与している可能性があることを示唆している。

自閉症スペクトラム障害 (ASD) は、社会的相互作用とコミュニケーションの欠如、および制限された反復的な行動によって定義される不均一な状態です。 ASD を持つ人は、発作、不安、知的障害などの追加の症状を示すことがよくあります1。 シナプス機能不全は ASD 病理の重要な特徴であり、この疾患のさまざまなマウス モデルの脳でも明らかです 2,3,4。 経験によって引き起こされるニューロン活動は、複数の遺伝子の転写を誘導することにより、神経回路におけるシナプスの発達と機能の調節に寄与しており 5,6 、このような活動依存性の転写調節の機能不全が ASD の発症に寄与する可能性があることが示唆されています。

クロモドメイン ヘリカーゼ DNA 結合タンパク質 8 (CHD8) をコードする遺伝子の変異は、ASD の浸透度の高い危険因子を構成します 7,8。 CHD8 は、ASD に関連する他の遺伝子のプロモーター領域を含む多くの遺伝子のプロモーター領域を標的とする ATP 依存性のクロマチン再構築因子であり、それによってその転写を制御します 9、10、11。 Chd8 ヘテロ接合変異マウスは、大頭症、不安様行動の増加、社会的行動の変化、および認知障害を示すことがわかっていますが、異なるグループによって生成された異なる Chd8 変異マウス系統の行動表現型は部分的にのみ重複します 12、13、14、15、16 、17． CHD8 の欠失は、皮質および小脳の発達中に前脳の興奮性ニューロンおよび小脳顆粒細胞の前駆細胞の増殖および分化の障害にもつながります 18,19。 さらに、CHD8 は希突起膠細胞の分化と髄鞘形成において重要な役割を果たしており、マウスの希突起膠細胞前駆細胞における CHD8 の除去により、Chd8 ヘテロ接合変異体マウスに特徴的な行動表現型のいくつかが発現します 20、21、22。 これらのさまざまな観察は、CHD8 が脳の前駆細胞の増殖と分化の中心調節因子であることを示唆していますが、CHD8 が有糸分裂終了ニューロンや成人の脳でも重要な役割を果たしているかどうかは不明でした。

我々は現在、タモキシフェンによって誘導されるCre組換えシステムを使用して、インビトロおよびインビボの成体脳の両方でマウスの有糸分裂ニューロンにおけるChd8欠失の影響を調べた。 われわれは、CHD8が培養ニューロンにおけるニューロン遺伝子および活動依存性遺伝子の発現を調節していることを発見した。 また、成人の脳における Chd8 の欠失により、カイニン酸 (KA) 誘発発作に関連する活動依存性の遺伝子発現が下方制御されることも発見しました。 我々の結果は、CHD8が神経前駆細胞だけでなく有糸分裂後ニューロンにおいても転写調節因子として機能することを示している。

有糸分裂後ニューロンにおける CHD8 の役割を調べるために、Cre リコンビナーゼ媒介 Chd8 ノックアウト (CAG-CreER/Chd8F/F) マウスとコントロール (Chd8F/F) マウス由来の初代海馬ニューロンを胎生日 (E) 18.5 で培養しました (図 1)。 1a)。 培養物をシトシン β-D-アラビノフラノシド (Ara-C) で処理して分裂細胞を除去し、その後 4-ヒドロキシタモキシフェン (4-OHT) に曝露して Chd8 コンディショナル ノックアウト (Chd8 CKO) ニューロンを生成しました。 Chd8 CKO培養物におけるChd8 mRNAの量は、対照培養物と比較して大幅に減少しました（図1b）。 培養細胞には、ニューロンに加えて、〜17％のアストロサイトと〜1％の希突起膠細胞が含まれていましたが、各細胞タイプの割合と細胞生存率は、Chd8 CKO培養物とコントロール培養物で同様でした（図1c、補足図1）。 これらの Chd8 CKO およびコントロール ニューロンを使用して RNA シーケンス (RNA-seq) 分析を実行しました (補足表 1)。 Chd8 CKOニューロンでは、対照ニューロンと比較して、509個の遺伝子の発現がダウンレギュレートされ、360個の遺伝子の発現がアップレギュレートされました（偽発見率（FDR）調整後のP値<0.05）（図1d）。 遺伝子オントロジー（GO）解析により、Chd8 CKOニューロンの下方制御された509個の遺伝子には、「翻訳」、「転写、DNA鋳型」、「神経系発達」、「シナプス構築の正の制御」に関連する遺伝子が豊富に含まれていることが明らかになった。上方制御された360個の遺伝子は、「細胞アミノ酸代謝プロセス」および「輸送」に関連する遺伝子の大幅な濃縮を示しました（図1e）。 SynGO分析により、Chd8 CKOニューロンの下方制御された遺伝子にはシナプス前および後機能に関連する遺伝子が豊富であるが、上方制御された遺伝子には有意な濃縮は示されていないことが明らかになりました（図1f、補足図2）。 さらに、京都遺伝子ゲノム百科事典（KEGG）経路の遺伝子セット濃縮分析（GSEA）により、リボソーム遺伝子がChd8 CKOニューロンで有意に下方制御されていることが示されました（図1g）。

a 一次ニューロンの培養、Cre 媒介組換えによる Chd8 の欠失、および KCl 誘発ニューロン脱分極の実験手順の概略図 (詳細は「方法」を参照)。 KCl 誘発脱分極の前にニューロン活動を低下させるために、Na+ チャネル遮断薬のテトロドトキシン (TTX) と N-メチル-D-アスパラギン酸 (NMDA) 受容体アンタゴニストの D-AP5 をニューロンに添加しました。 b 5 mM または 55 mM KCl で処理したコントロールおよび Chd8 CKO ニューロンにおける Chd8 mRNA の逆転写 (RT) およびリアルタイム ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 分析。 データは平均値 ± 標準誤差 (各遺伝子型の n = 3 匹のマウス) です。 **P < 0.01、****P < 0.0001 (Tukey の事後検定による一元配置分散分析)。 c 10日間培養した初代ニューロンの位相差顕微鏡写真。 スケールバー、50 μm。 d RNA-seq分析によって決定された5 mM KCl条件下での対照ニューロンと比較した、Chd8 CKOニューロンで差次的に発現された遺伝子のボルケーノプロット（各遺伝子型のn = 3マウス、Chd8 CKOマウスの場合は雄1匹と雌2匹、および雄2匹、およびコントロールマウスにはメス1匹）。 差次的に発現された遺伝子 (FDR 調整 P 値 <0.05) は赤色で強調表示されます。 e Chd8 CKOニューロンにおいて発現が上方制御された遺伝子（360遺伝子）または下方制御された遺伝子（509遺伝子）のGO分析。 f Chd8 CKOニューロンにおいて発現が下方制御された遺伝子（509遺伝子）のSynGO分析。 g 5 mM KCl 条件下での対照ニューロンと比較した Chd8 CKO ニューロンの KEGG 経路の GSEA。 NES、正規化されたエンリッチメント スコア。

細胞外 KCl 濃度の増加によって媒介されるニューロンの脱分極は、活性依存性遺伝子の発現を誘導します 23。 したがって、我々は次に、培養された分裂終了ニューロンにおいて、ニューロン活動に応答した遺伝子発現の誘導がChd8除去によって変化するかどうかを調べた。 55 mM KClで2時間処理した対照ニューロンは、5 mM KClで処理したものと比較して、Arc、Egr1、Fos、Fosb、Npas4、Nr4a1などの活性依存性遺伝子の発現の有意な増加を示しました（図2a、補足）表2)。 mRNA量のピークは、Egr1の場合は〜1時間、FosbおよびNr4a1の場合は〜2時間で発生し、これらのmRNAの量はその後徐々に減少しました（補足図3a〜c）。 55 mM KClで処理したニューロンでは、Chd8アブレーションにより775個の遺伝子の発現が下方制御され、404個の遺伝子の発現が上方制御されました（FDR調整P <0.05）（図2b、補足表3）。 これらの差次的に発現される遺伝子の中で、Egr1、Fosb、Nr4a1 などの活性依存遺伝子の発現は、Chd8 CKO ニューロンで大幅に下方制御されました（図 2b、c）。 イムノブロット分析により、タンパク質レベルでの活性依存性のFOSBの発現が、対照ニューロンと比較してChd8 CKOニューロンで大幅に減弱していることが確認されました（補足図3d–f）。 また、55 mM KClで処理した対照ニューロンと55 mM KClで処理したコントロールニューロンにおいて、log2(倍変化)>2.0、FDR調整P値<0.01と関連する190個のKCl誘発遺伝子のRNA-seqデータも調べました。 mM KCl (図 2a)。 GSEAは、これらのKCl誘導性遺伝子の発現が、55 mM KCl条件下で対照ニューロンと比較してChd8 CKOで下方制御されたことを明らかにしました（図2d）。 さらに、KEGG 経路の SynGO 分析と GSEA により、この条件下で対照ニューロンと比較して Chd8 CKO ニューロンで発現が大幅に下方制御された遺伝子には、シナプスとリボソームに関連する遺伝子が含まれていることが明らかになりました（補足図4a-c）。 5 mM KCl 条件および 5 mM KCl 条件下での Chd8 CKO ニューロンと対照ニューロンの間で発現差のある遺伝子（FDR 調整 P < 0.05）を比較すると、227 個の上方制御遺伝子と 426 個の下方制御遺伝子が 55 mM KCl 処理によって特異的に同定されたことが示されました（図 2e、補足図）。 . 4d ～ f、補足表 4)。 GO分析により、これらの下方制御された遺伝子には、「転写、DNA鋳型」、「mRNAプロセシング」、「神経系発達」、および「カルシウムイオンに対する細胞反応」に関連する遺伝子が豊富であることが明らかになりました（図2f）。

対照マウスから単離され、55 mM KCl 対 5 mM KCl で処理されたニューロンにおける示差的に発現された遺伝子のボルケーノ プロット (条件あたり n = 3 マウス)。 差次的に発現された遺伝子 (FDR 調整 P 値 <0.05) は赤色で強調表示されます。 b 55 mM KCl条件下での対照ニューロンと比較した、Chd8 CKOニューロンで差次的に発現された遺伝子のボルケーノプロット（各遺伝子型のn = 3マウス、Chd8 CKOマウスの場合は雄1匹と雌2匹、対照マウスの場合は雄2匹と雌1匹）。 差次的に発現された遺伝子 (FDR 調整 P 値 <0.05) は赤色で強調表示されます。 c 5 mMおよび55 mM KCl条件下でのChd8 CKOおよび対照ニューロンにおける活性依存性遺伝子の発現を表すヒートマップ（各条件につきn = 3マウス）。 55 mM KCl条件下で対照ニューロンと比較して、Chd8 CKOニューロンにおいて差次的に発現される遺伝子をアスタリスクで示す。 d KClによって誘導された遺伝子間で差次的に発現された遺伝子のGSEAプロット（55 mM KClで処理された対照マウスのニューロンと処理マウスのニューロンにおけるlog2（変化倍数）が2を超える上方制御された遺伝子は、55 mM KClで処理されたコントロールマウスのニューロンにおいて<0.01と関連） a) で 5 mM KCl を使用した Chd8 CKO ニューロンについて、55 mM KCl 条件下での対照ニューロンと比較しました。 NES、正規化されたエンリッチメント スコア。 e 5 mMおよび55 mM KCl条件下で対照ニューロンと比較して、Chd8 CKOニューロンにおいて発現が上方制御または下方制御された遺伝子間の重複を示すベン図。 f eに示すように、55 mM KClで処理したChd8 CKOニューロンにおいて発現が特異的に上方制御された遺伝子（227遺伝子）または下方制御された遺伝子（426遺伝子）のGO分析。 P および FDR q の値の有意水準は、<0.05 の場合は *、<0.01 の場合は **、<0.001 の場合は ***、<0.0001 の場合は **** で示されます。

クロマチンリモデリング因子としてのCHD8の役割を考慮して、トランスポザーゼアクセス可能なクロマチン（ATAC）-seq分析のアッセイを実行し、5または55 mM KClで2時間処理した後のChd8 CKOおよびコントロールニューロンにおけるゲノム全体のクロマチンアクセス可能性を評価しました。 。 ATAC-seq ピークの大部分 (全ピークの 50.2 ～ 78.2%) は、これら 4 つの条件間で共有されました (図 3a)。 以前に公開されたデータ12の高信頼性CHD8クロマチン免疫沈降（ChIP）-seqピーク周辺のヒートマップと密度プロファイルは、Chd8 CKOとコントロールニューロンの間のATAC-seqシグナル強度の同様の分布パターンを明らかにしました（図3b、補足図5a）。 また、Fosb、Nr4a1、Homer1、および Egr3 を含むいくつかの活性依存遺伝子の遺伝子座でのクロマチンのアクセス可能性も調べました。これらの遺伝子はすべて、55 mM KCl 条件下で対照ニューロンと比較して Chd8 CKO ニューロンで下方制御されていました。 アクセス可能なクロマチン部位と重複する CHD8 ピークが、これらのゲノム遺伝子座またはその近くで検出されました (図 3c)。 これらの領域のいくつかのATAC-seqピークのシグナル強度はニューロン活動に応答して増加しましたが、シグナル分布パターンは2つの遺伝子型で類似していました（図3c、補足図5b）。 さらに、ChIP 定量的ポリメラーゼ連鎖反応 (qPCR) 分析を実行して、ヒストン H3 (H3K4me3) の存在量および RNA ポリメラーゼ II 動員のトリメチル化 Lys4 に対する Chd8 欠失の影響を調べました。 いくつかの活性依存性遺伝子の転写開始部位 (TSS) 周囲の H3K4me3 または RNA ポリメラーゼ II 濃縮の程度は、55 mM KCl 条件下ではコントロール ニューロンよりも Chd8 CKO ニューロンで高い傾向がありましたが、これらの差は統計的有意性を達成しませんでした。 (図 3d、e)。

Chd8 CKOまたは雄マウスから単離され5または55 mM KClに曝露された対照ニューロンで検出されたATAC-seqピーク間の重複を示すベン図（条件あたりn = 2マウス）。 各条件の 2 つの独立した ATAC-seq 複製の結合データを分析に使用しました。 各条件の2つの複製の個別の結果を補足図5に示します。 b CHD8結合ピークの中心の上流3 kbから下流3 kbまでにわたる領域におけるATAC-seqピークの信号密度とヒートマップのグループ化。 CHD8 ChIP-seq データは以前の研究からのものです12。 c Integrative Genomics Viewer ブラウザーで表示された、代表的な活性依存遺伝子の ATAC-seq、CHD8 ChIP-seq、および RNA-seq データ。 黄色の影付き領域は、ATAC-seq ピークと ChIP-seq ピークの顕著な重複を示します。 d、e ChIP-qPCR分析は、海馬の示された活性依存性遺伝子のTSS領域（またはネガティブコントロールとして調べたHomer1の上流領域）でのH3K4me3沈着（d）およびRNAポリメラーゼII結合（e）について実行されました。 Chd8 CKOマウスまたはコントロールマウスから単離し、55 mM KClで2.0時間処理したニューロン。 ChIP は、H3K4me3 または RNA ポリメラーゼ II に対する抗体の対照として正常な免疫グロブリン G (IgG) を使用して実行されました。 データは平均値 ± 標準誤差 (n = 3 回の独立した実験) です。 P 値は、対応のないスチューデントの t 検定を使用して決定されました。

次に、8〜12週齢のCAG-CreER/Chd8F/Fマウスにタモキシフェンを5日間連続腹腔内投与することにより、成人期のCHD8欠損マウス（以下、Chd8 CKOマウスと呼ぶ）を作製した。 mRNAおよびタンパク質レベルでのChd8発現の喪失に反映されるように、Chd8のフロックス（F）対立遺伝子がChd8 CKOマウスの海馬で効率的に削除されたことを確認しました（図4a、補足図6a、b）。 CHD8 が in vivo で活性依存性遺伝子の発現を調節するかどうかを調べるために、グルタミン酸受容体アゴニスト KA の注射により、Chd8 CKO マウスと対照マウスの脳に広範なニューロン活動を誘導しました。 KA治療後のChd8 CKOマウスと対照マウスの間の発作重症度の有意な差は検出されませんでしたが（図4b）、海馬におけるFosb、Nr4a1、およびEgr1を含む活性依存遺伝子の発現は、Chd8 CKOマウスで有意に下方制御されました。 KA治療後60分における同様の発作段階の対照マウスとの比較（図4c）。 KA 治療後の Chd8 CKO マウスの海馬では、FOSB タンパク質の量も対照マウスの海馬と比較して有意に減少しました（補足図 6a、c）。 Chd8 アブレーションが in vivo でクロマチンへのアクセス性を変化させるかどうかを調べるために、ビヒクル治療後の Chd8 CKO マウスと対照マウス、または KA 治療後 60 分の時点で同様の発作段階にあるマウスの海馬に対して ATAC-seq 解析を実行しました。 ほとんどの ATAC-seq ピーク (全ピークの 51.6 ～ 74.0%) は、これら 4 つの条件間で共有されました (図 4d)。 高信頼性 CHD8 ChIP-seq ピーク周辺のヒート マップと密度プロファイルにより、KA またはビヒクル処理後のコントロール マウスと比較して、Chd8 CKO マウスの海馬における ATAC-seq シグナル強度のわずかな減少が明らかになりました（図 4e、補足図。 7a)。 Fosb、Nr4a1、および Egr1 を含むいくつかの活性依存遺伝子の遺伝子本体でのクロマチンのアクセス可能性は、コントロールと Chd8 CKO 海馬の両方で KA 処理によって増加しました（図 4f、補足図 7b）。 さらに、これらの遺伝子座におけるATAC-seqシグナル強度は、KA治療後の対照マウスの海馬と比較して、Chd8 CKOマウスの海馬において減少した（図4f、補足図7b）。 したがって、これらの結果は、CHD8 が in vivo で活性化されたニューロンの活性依存遺伝子の転写およびクロマチンへのアクセスに必須であることを示しました。

8〜18週齢で5日間連続タモキシフェンで治療した後の17〜18週齢のCAG-CreER/Chd8F/F（Chd8 CKO）およびChd8F/F（コントロール）雄マウスの海馬におけるChd8 mRNAのRT-qPCR分析。 12 週齢 (各遺伝子型のマウス n = 6 匹)。 b 16〜18週齢のChd8 CKO（n = 12）および対照（n = 14）雄マウス（左パネル）またはChd8 CKO（n = 18）および対照におけるKA注射後の60分間の発作スコアの時間経過(n = 16) 生後 13 ～ 18 週の雌マウス (右パネル)。 c ビヒクルで治療したChd8 CKOマウス（n = 6）、ビヒクルで治療した対照マウス（n = 6）、KAで治療したChd8 CKOマウス（n = 9)、および 16 ～ 18 週齢で KA で治療した対照マウス (n = 7)。 この分析では、発作段階 3 ～ 5 の雄マウスを研究しました。 データは、Chd8 CKOの海馬で検出されたATAC-seqピークと、KAまたはビヒクル処置後60分の同様の発作段階を有する対照マウスとの海馬で検出されたATAC-seqピーク間の重複を示すベン図である（各条件当たりn = 2匹のマウス：雄1匹、雄1匹、およびChd8 CKOおよびKAで処置した対照マウスについては1匹の雌、Chd8 CKOおよびビヒクルで処置した対照マウスについては2匹の雄）。 各条件の 2 つの独立した ATAC-seq 複製の結合データを分析に使用しました。 各条件の2つの複製の個別の結果を補足図7に示します。 e CHD8結合ピークの中心の上流3 kbから下流3 kbまでにわたる領域におけるATAC-seqピークのシグナル密度とヒートマップのグループ化。 f Integrative Genomics Viewer ブラウザーで表示された代表的な活性依存遺伝子の ATAC-seq シグナル。 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001 ((a) は対応のない Student t 検定、(b) は二元配置反復分散分析、および一元配置分散分析) (c) の Tukey の事後テストを使用)。

活動依存性遺伝子発現の調節不全が記憶形成および精神障害と関連していることを考慮して、Chd8 CKO マウスと対照の雄マウスおよび雌マウスを用いていくつかの行動試験を実施しました。 モリス水迷路テストでは、連続 5 日間にわたる可視および非表示のプラットフォーム試験により、脱出潜時が Chd8 CKO マウスとコントロール マウスで同様であることが明らかになりました (図 5a)。 見えるプラットフォームと隠れたプラットフォームのトライアルで訓練した後、隠れたプラットフォームを水迷路から取り除くプローブトライアルを実行しました。 標的プラットフォーム横断の数は、Chd8 CKOマウスと対照の雄または雌マウスの間で差はありませんでした（図5b）。 Chd8 CKOマウスとコントロールマウスの両方で、ターゲット象限で費やされる時間は、他の象限のそれぞれに比べて大幅に増加しました（図5c）。これは、Chd8 CKOマウスにおける正常な学習と記憶形成を示唆しています。

a 11〜15週齢のChd8 CKO（n = 18）および対照（n = 20）雄マウス（左パネル）またはChd8 CKO（n = 16) および対照 (n = 18) の生後 11 ～ 16 週の雌マウス (右パネル)。 データは平均値±標準偏差、c (a) のマウスを用いて行われたモリス水迷路テストのプローブ試験の 6 日目にプラットフォームを取り外した後のターゲット横断の数 (b) および各象限で費やした時間 (c)。 T、O、L、R はそれぞれターゲット、反対側、左、右の象限を表します。 灰色の円はターゲット プラットフォームを表します。 データは箱ひげ図として表示されます。箱の下端と上端はそれぞれ 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルを示し、中央の棒は中央値を示し、ひげは外れ値以外の極値を示します。 **P < 0.01、***P < 0.001、****P < 0.0001 (二元配置反復分散分析 (a)、二元要因分散分析 (b)、または Tukey の事後検定を使用した一元配置分散分析 ( c))。

次に、CHD8 ハプロ不全マウスを含む ASD モデルマウスに典型的な不安様行動と異常な社会的行動を調べました12、13、14、15。 オープンフィールドテストで移動した合計距離は遺伝子型間で差がなく、Chd8 CKOマウスの正常な運動活動を示唆しています（図6a）。 オープンフィールドの中心で過ごす時間は、対照マウスと比較して雄のChd8 CKOマウスでは減少しましたが、雌のChd8 CKOマウスでは対照マウスの時間と同様でした（図6b）。 高架十字迷路テスト中にオープンアームで過ごした時間、または明暗移行テスト中に明室で過ごした時間については、遺伝子型間の違いは検出されませんでした（図6c、d）。 雄および雌のChd8 CKOマウスも、正常な自己毛づくろい行動を示しました（図6e）。 雌のChd8 CKOマウスは、相互社会的相互作用テスト中に総接触時間の増加を示しましたが、雄ではありませんでした（図6f）。 この試験中の社会的接触の数は、Chd8 CKOマウスと対照マウスの間で差はありませんでした（図6g）。 3室社交性テストでは、Chd8 CKO動物と対照動物の両方が新規マウス（見知らぬ人1）に対して顕著な選好を示しました（図6h、i）。 社会的新規性選好テストでは、Chd8 CKO マウスと対照雄マウスの両方が、馴染みのあるマウス (見知らぬ人 1) よりも新規なマウス (見知らぬ人 2) に対して有意な選好を示しましたが、どちらの遺伝子型の雌マウスもそのような選好を示さなかったのです (図6j、k)。 したがって、これらの結果は、成人の脳におけるChd8除去が行動特性に選択的な影響を与えることを示唆しました。

a、b 14〜16週齢のChd8 CKO（n = 18）および対照（n = 20）の雄マウスを用いて実施されたオープンフィールドテストの総移動距離（a）および中央エリアで費やした時間（b）または、Chd8 CKO (n = 16) および対照 (n = 18) の生後 12 ～ 17 週の雌マウス。 c 15〜17週齢のChd8 CKO（n = 18）および対照（n = 20）の雄マウス、またはChd8 CKO（n = 16）および対照を用いて実施された高架十字迷路試験のオープンアームで費やした時間(n = 18) 生後 12 ～ 17 週の雌マウス。 d 14〜17週齢のChd8 CKO（n = 18）および対照（n = 20）の雄マウス、またはChd8 CKO（n = 16）および対照を用いて実施された明暗移行試験の明室で費やした時間(n = 18) 生後 12 ～ 17 週の雌マウス。 e 11〜16週齢のChd8 CKO（n = 16）および対照（n = 17）雄マウス、またはChd8 CKO（n = 16）および対照（n = 18) 13～18週齢の雌マウス。 f、g 15〜17週目にChd8 CKO（n = 9）および対照（n = 10）の雄マウスを用いて実施された、新しい環境における社会的相互作用テストの合計接触時間（f）および接触回数（g） 、または Chd8 CKO を有する生後 12 ～ 17 週の雌マウス (n = 7) および対照 (n = 9) のマウス。 h、i 16〜18週目にChd8 CKO（n = 18）および対照（n = 20）の雄マウスを用いて実施された3室社交性テストの雄マウスの代表的な痕跡（h）および各ケージの周りで費やした時間（i） 、または Chd8 CKO を有する生後 13 ～ 17 週の雌マウス (n = 16) および対照 (n = 18) のマウス。 スケールバー、5cm。 j、k h および i のマウスを使用して実行された 3 室の社会的新規性選好テストの雄マウスの代表的なトレース (j) と各ケージの周りで費やした時間 (k)。 スケールバー、5cm。 データは箱ひげ図として表示されます。箱の下端と上端はそれぞれ 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルを示し、中央の棒は中央値を示し、ひげは外れ値以外の極値 (a ～ g、i、 k)。 *P < 0.05、**P < 0.01、****P < 0.0001 (Tukey の事後検定 (a – g) または対応のある Student の t 検定 (i、k) を使用した二元配置要因分散分析)。

我々はここで、マウスの有糸分裂終了ニューロンにおけるChd8のホモ接合性欠失により、活性依存性遺伝子の発現が変化することを示した。 また、成人の脳における Chd8 の発現は、モリス水迷路テストにおける発作感受性や記憶形成には必須ではないが、KA 誘発発作に関連する活動依存性遺伝子の転写には必要であることも発見した。 したがって、我々のデータは、有糸分裂後ニューロンにおける活性依存性の転写応答における CHD8 の役割についての洞察を提供します。

CHD8 は、転写制御を通じて多くの種類の幹細胞および前駆細胞の増殖と分化を調節することが以前に示されています 18、19、20、21、24、25、26。 Chd8 の発現は成人の脳でも持続しますが 27、有糸分裂後ニューロンにおける CHD8 の機能的役割は不明です。 我々の結果は、CHD8がニューロン活動に応答した転写制御に寄与していることを示している。 活動依存性の遺伝子発現は、学習と記憶の基礎となるシナプスの発達と可塑性を媒介し6、その破壊はASDなどの精神神経疾患に関連しています5。 この研究では、雄の Chd8 CKO マウスのオープンフィールド試験で不安様行動の増加や雌の Chd8 CKO マウスで異常な社会的行動を含む選択的行動異常が検出されたのに対し、Chd8 ヘテロ接合ノックアウトマウスはシナプス伝達の変化、ASD 様の行動を示します。表現型、学習および記憶障害12、13、14、15、28。 したがって、我々の観察は、CHD8による活性依存性の転写制御の欠陥が、CHD8変異に関連するASD患者の神経学的表現型に寄与している可能性があることを示唆している。 Chd8 CKOニューロンでは、活性依存性遺伝子の発現変化に加えて、下方制御された遺伝子の中で翻訳に関連する遺伝子が高度に濃縮されていることも判明した。 ニューロンにおける局所翻訳は、シナプス可塑性とニューロン機能に必要なタンパク質を軸索とシナプスに供給します29。 翻訳の調節不全は、ASD 様の表現型に以前から関与していると考えられてきました 30。 したがって、CHD8 は、転写、翻訳、神経系発達などの複数のプロセスに関連する転写制御に寄与しており、CHD8 変異に関連するこれらのプロセスの制御欠陥が ASD の病因の根底にある可能性があります。

ニューロンの活動は、成人の脳における活動依存性の遺伝子発現に関連して、アクセス可能なクロマチンの状況を動的に変化させます 31。 対照的に、我々の ATAC-seq 分析では、以前の発見と同様に、KCl の上昇した濃度に曝露された培養ニューロンにおけるクロマチンのアクセス可能性のわずかな変化しか明らかにしませんでした 32。 クロマチンのアクセシビリティに対するニューロン活動の影響におけるこれらの違いは、生体内ニューロンと培養ニューロンの間の実験条件の違いによるものである可能性があります。 実際、KA 処理マウスの海馬の ATAC-seq 解析では、活性依存性遺伝子の遺伝子本体におけるクロマチンのアクセス可能性が増加していることが明らかになりました。 CHD8 がいくつかの細胞型で開いたクロマチン構造の採用を促進するというこれまでの発見と一致して、成人の脳における Chd8 の除去により、活性依存性遺伝子座におけるクロマチンのアクセス可能性が低下することがわかりました。 おそらく技術的な限界の結果として、in vitro では Chd8 欠失に応じたクロマチン アクセシビリティの変化は検出されませんでしたが、CHD8 が培養ニューロンのクロマチン アクセシビリティにもある程度影響を与えている可能性があり、その可能性についてはさらなる調査が必要です。 CHD8が活性依存性遺伝子のプロモーター領域に結合することを考えると、これらの遺伝子の調節要素でのクロマチンへのアクセスを促進し、それによって活性依存性の転写を促進する可能性があります。 CHD8による転写制御の詳細な機構を解明するには、さらなる研究が必要である。

CHD8 ハプロ不全は ASD の浸透度の高い危険因子であり、Chd8 ヘテロ接合変異はマウスに ASD 様の行動表現型を与えます 7、12、13、14、15、16、17。 CHD8 変異に関連する ASD 患者の中には発作を経験する人もいます 7 が、Chd8 CKO マウスでは発作感受性の変化は検出されませんでした。 相互社会的相互作用テスト中の合計接触時間の増加などの異常な社会的行動は、Chd8 変異マウスの再現可能な行動特徴の 1 つです 12、13、16、17、21。 本研究における雌の Chd8 CKO マウスは、雄ではなく、性的二型表現型を示唆する社会的行動の変化を示しました 15。 さらに、Chd8 CKO雄マウスは、オープンフィールド試験では不安様行動の増加を示しましたが、高架十字迷路試験や明暗移行試験ではそうではありませんでした。 不安は ASD1、7 を持つ個体の症状の 1 つであり、Chd8 ヘテロ接合変異マウスも不安様の行動を示します 12、13。 私たちの結果は、成人の脳内のCHD8が社会的行動や不安様行動の制御に寄与している可能性があることを示唆しています。

性的二型の行動表現型は、Chd8 変異マウスを含む ASD モデルマウスで以前に観察されています 15。 性ホルモンと性染色体が行動における性差に関与していることを考えると、Chd8 の欠失により性ホルモンのレベルやその受容体の発現が変化する可能性があります。 遺伝的背景、年齢、突然変異の違いも、性的二形性の行動結果に影響を与える可能性があります 35,36。

我々は、CAG-CreERマウス株を使用して、インビトロでのマウス有糸分裂ニューロンおよびインビボでの成体の脳でタモキシフェン誘導性Chd8欠失を達成しました。 この系統が細胞型特異性を示すのではなく、すべての細胞型で組換えを促進することを考えると、有糸分裂終了ニューロンだけでなく、グリア細胞や他の細胞集団における Chd8 欠失は、この研究で観察されたトランスクリプトーム、エピジェネティック、および行動の変化に影響を与える可能性があります。 これらの変化が有糸分裂後ニューロンの変化に起因するかどうかを判断するには、さらなる研究が必要です。

CHD8 は、転写制御および行動表現型において用量依存的な役割を持つことが以前に示されています 33,37。 今回の研究では、成人の脳における Chd8 のホモ接合性欠失が転写変化と一部の行動障害を引き起こしたことを考えると、Chd8 ヘテロ接合性変異が同様ではあるがそれほど顕著ではない影響を与える可能性もあります。 まとめると、今回の発見は、有糸分裂終了ニューロンおよび成人の脳における活性依存性の転写制御におけるCHD8の役割を明らかにし、したがってASDの病因の根底にある分子機構について潜在的に重要な洞察を提供するものである。

Chd8F/F マウスの作製は以前に記載されています 12。 Chd8F/F マウスと CAG-CreER ヘテロ接合マウスを交配して、CAG-CreER/Chd8F/F マウスを作製しました 24。 in vivoでのCre媒介組換えの誘導のため、8〜12週齢のCAG-CreER/Chd8F/Fマウスに、コーン油に溶解したタモキシフェン（マウス1匹あたり2mg）を5日間連続腹腔内注射した。 タモキシフェンによる複数回の治療により、単回治療と比較してフロックス化対立遺伝子がより効率的に削除されます38。 Chd8 (5'-CCCAAAAGACCAAATCAAACAAAC-3'、5'-CCATAGGCTGAAGAACCGTAATTG-3'、および 5'-AGGCTTAGAAACCCGTCGAG-3') および Cre (5'-AGGTTCGTTCACTCATGGA-3) のプライマーを使用したゲノム DNA の PCR ベースの分析によって、マウスの遺伝子型を特定しました。 'および5'-TCGACCAGTTTAGTTACCC-3'）。 すべての実験は金沢大学動物倫理委員会によって承認されました。

一次ニューロンは、以前に記載されているように、E18.5 でオスおよびメスのマウスの海馬から単離されましたが、若干の変更が加えられました 23,39。 錐体ニューロンの生成はこの段階でほぼ完了しており、胚組織からのニューロンの単離には、組織がより容易に解離され、グリア細胞や線維芽細胞の汚染が最小限に抑えられるという利点があります。 簡単に説明すると、組織を 0.25% トリプシン-EDTA および 25 μg/ml の DNase (047-26771、Wako) とともに 37 °C で 20 分間インキュベートし、その後パスツールピペットを繰り返し通過させることによって穏やかに解離させました。 10% ウシ胎児血清および DNase (10 μg/ml) を補充したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) を添加します。 解離した細胞を 40 μm のセルストレーナーに通し、遠心分離で回収し、ポリ-D-リジン (P6407、Sigma-Aldrich) でコーティングしたプレートに移し、MACS NeuroBrew-21 を添加した神経基礎培地で 37 °C で培養しました。サプリメント (130-097-263、Miltenyi Biotec) 20 ml/l、2 mM L-グルタミン (25030081、Thermo Fisher Scientific)、およびペニシリン - ストレプトマイシン (15140122、Thermo Fisher Scientific) 10 ml/l。 in vitro (DIV) で 2 日後、培養物を 1 μM Ara-C で 24 時間処理して、すべての分裂細胞を除去しました。 in vitro での Cre 媒介組換えの誘導のために、ニューロンを 4 DIV で 500 μM 4-OHT の存在下で 24 時間インキュベートしました。 KCl 誘発ニューロン脱分極の場合、1 μM テトロドトキシン (Wako) および 100 μM D-AP5 (Tocris Bioscience) を 9 DIV で培地に添加してニューロン活動を低下させ、その後ニューロンを 5 または 55 mM KCl で 2 分間処理しました。 h コントロールバッファー (5 mM KCl、165 mM NaCl、1.8 mM CaCl2、0.8 mM MgCl2、11 mM HEPES) または脱分極バッファー (170 mM KCl、1.8 mM CaCl2、0.8 mM MgCl2、11 mM HEPES) を最終希釈液に添加することにより10 DIV で 32.4%

CHD8 に対するウサギ ポリクローナル抗体は社内で生成され、免疫ブロット分析に使用されました。 その他の抗体には、免疫蛍光染色用の TUBB3 (ab78078、Abcam、1:500)、GFAP (IR524、DAKO、1:500)、および Olig2 (AB9610、Millipore、1:500) に対する抗体、FOSB に対する抗体 (ab184938、イムノブロット分析用の HSP90 (610419、BD Biosciences、1:2000)、および H3K4me3 (ab8580、Abcam、サンプルあたり 2 μg) および RNA ポリメラーゼ II (91151、Active Motif、2 μg) に対するものChIP の場合はサンプルごとに）。

免疫蛍光染色は、以前に記載されているように実行されました21。 培養細胞を、リン酸緩衝食塩水 (PBS) 中の 4% パラホルムアルデヒドを用いて 4 °C で一晩固定し、PBS 中の 2% ウシ血清アルブミンおよび 0.3% Triton X-100 に曝露し、その後、一次溶媒と 4 °C で一晩インキュベートしました。抗体。 免疫複合体は、Alexa Fluor 488 または Alexa Fluor 546 結合ヤギ二次抗体 (Thermo Fisher Scientific) で検出されました。 TUNEL (ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ dUTP ニックエンド標識) アッセイは、MEBSTAIN アポトーシス TUNEL キット ダイレクト (8445、MBL) を使用して実行されました。 すべての細胞を 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で対比染色し、BZ-X800 顕微鏡 (Keyence) で画像を取得しました。 ImageJ ソフトウェアを適用して、各細胞タイプまたはアポトーシス細胞の数を数えました。

TRIzol 試薬 (Thermo Fisher Scientific) を使用して培養ニューロンまたは海馬から単離した全 RNA (500 ng) を、gDNA リムーバー (Toyobo) を含む ReverTra Ace RT ミックスを使用して RT に供しました。 得られたcDNAを、Luna Universal qPCR Master Mix (M3003、New England Biolabs)および特定のプライマーを使用して、Thermal Cycle Dice Real Time System III (Takara Bio)でリアルタイムPCR分析に供した。 データは、Rplp0 または Gapdh mRNA の量によって正規化されました。 PCRプライマー（それぞれセンスおよびアンチセンス）は次のとおりでした：Rplp0、5'-GGACCCGAGAAGACCTCCTT-3'および5'-GCACATCACTCAGAATTTCAATGG-3'。 Gapdh、5'-GCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3' および 5'-GAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGTCG-3'。 Chd8L、5'-TCCCTTTTTTGGTCATTGCTC-3'および5'-TTCAGCCTATGGGCTTCATC-3'; Fosb、5'-TTTTCCCGAGACTACGACTC-3'および5'-GTGATTGCGGTGACCGTTG-3'。 Nr4a1、5'-TTGAGTTCGGCAAGCCTACC-3'および5'-GTGTACCCGTCCATGAAGGTG-3'。 およびEgr1、5'-TCGGCTCCTTTCCTCACTCA-3'および5'-CTCATAGGGTTGTTCGCTCGG-3'。

総タンパク質抽出物は培養ニューロンまたは海馬から調製され、以前に記載されているようにイムノブロット分析に供されました40。 ImageJ ソフトウェアを適用して、各タンパク質のシグナル強度を測定しました。

5 mM または 55 mM KCl で処理したニューロンから TRIzol 試薬を使用して全 RNA を抽出しました。 NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (New England Biolabs) を使用して全 RNA から精製したメッセンジャー RNA (1 μg) を使用して、NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit を使用して cDNA ライブラリーを調製しました。次いで、各ライブラリーを、Illumina (New England Biolabs) 用に配列し、NovaSeq 6000 システム (Illumina) を使用して配列決定した。 生の配列決定データの品質は FastQC (バージョン 0.11.9) でチェックされ、アダプター配列のトリミングは Trimmomatic (バージョン 0.39) で実行されました 41。 各 mRNA の総量は、HISAT2 (バージョン 2.1.0)42、featureCounts (バージョン 2.0.0)43、DESeq2 (バージョン 1.26.0)44 を含む一連のプログラムを使用して計算されました。 RNA-seq リードはマウス (mm10) ゲノムに対してマッピングされました。 GSEA は、GSEA ソフトウェア バージョン 4.2.145 を使用して前述のように実行されました。 5 mM KClで処理したものと比較して、55 mM KClで処理した対照ニューロンにおいて発現が有意に上方制御された遺伝子セット(FDR調整P値<0.01と関連するlog2(倍変化)>2.0)をGSEAに使用しました。 。 差次的に発現された遺伝子 (FDR q < 0.05) の GO 解析は、DAVID46 および SynGO47 を使用して実行されました。

ATAC-seq ライブラリーは、ATAC-Seq Kit (Active Motif) を使用して調製しました。 雄マウスから単離したChd8 CKOおよび対照ニューロンを5または55 mM KClで2時間処理し、その後DNase (15 μg/ml)を含む培地中で37℃で30分間インキュベートしました。 次に、0.25% トリプシン-EDTA に曝露することにより、ニューロンを培養プレートから分離しました。 KAまたはビヒクル処理の60分後に、同様の発作段階を有する各遺伝子型のマウスの脳から海馬を手動で分離した。 ATAC Lysis Bufferを用いて培養細胞または海馬から核を抽出し、1×105個の核を用いて各ATAC-seqライブラリーを調製した。 ライブラリーは、HiSeq 2500 システム (Illumina) を使用して配列決定されました。 リードは、Bowtie ソフトウェア (バージョン 2.2.3) を使用してマウス (mm10) ゲノムに一意にマッピングされ 48、重複したリードは samtools (バージョン 1.9) で削除されました 49。 各条件の 2 つの複製の BAM ファイルが samtools とマージされました。 ゲノムの著しく濃縮された領域は、MACS ピーク コーラー (バージョン 2.1.1、オプション "-p 1e−5 --gsize mm --nomodel --extsize 160") を使用して特定されました50。 ヒート マップと密度プロファイルは、deepTools (3.5.0)51 の plotHeatmap を使用して生成されました。

ChIP は基本的に前述のように実行されました 21。 55 mM KCl で 2 時間処理した培養ニューロンを、0.5% パラホルムアルデヒドを含む ChIP 緩衝液（5 mM HEPES-KOH (pH 8.0)、200 mM KCl、1 mM CaCl2、1.5 mM MgCl2、5 ％スクロース、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０）にプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｗａｋｏ）を添加し、超音波処理し、ミクロコッカスヌクレアーゼで３０℃で４０分間消化した。 EDTA を最終濃度 0.1 mM で添加した後、各消化サンプルを 4 °C で 15,000 × g で 10 分間遠心分離し、得られた上清を磁気結合抗体と 4 °C で 6 時間回転させながらインキュベートしました。ビーズ。 結合タンパク質をビーズから溶出し、Tris-EDTA 緩衝液中の 1% SDS とともに 65 °C で一晩インキュベートすることにより架橋を逆転させました。 ChIPバッファーおよびTris-EDTAバッファーの両方で2回洗浄した後、Nucleo Spin GelおよびPCR Clean-Up（タカラバイオ）を使用してDNAを精製し、上記のようにリアルタイムPCR分析に供した。 ＰＣＲプライマー（それぞれセンスおよびアンチセンス）は以下の通りであった：Ｅｇｒ３ ＴＳＳ、５'−ＧＧＡＡＧＧＣＴＴＧＧＴＴＧＧＡＧＡＣ−３'および５'−ＧＣＡＣＣＴＡＣＣＴＣＣＣＴＣＣＡＧＴＣ−３'。 Fosb TSS、5'-AGCCTGGACTTTCAGGAGGT-3' および 5'-GCTCGGGGAAGCTTAGTCTC-3'。 Nr4a1 TSS、5'-AACCTGCACTGGGGTATCAC-3' および 5'-GACAAAGCTTGGCTTCCTTG-3'。 Homer1 TSS、5'-GCCTTTAGGAGGGGAGAAAG-3' および 5'-GGGGAAAACCACCGTTAAT-3'。 Homer1 上流、5'-TCTGCCACCTCATTTCTGCT-3' および 5'-TAGCACACACAGGCCATCAT-3'。

CHD8 に対する抗体 (DRA003116) を使用して以前に取得された ChIP-seq データは、元の研究で説明されているように再解析されました 12。 簡単に言うと、Bowtie ソフトウェア (バージョン 2.2.3) を使用してリードをマウス (mm10) ゲノムに一意にマッピングし 48、重複したリードを samtools (バージョン 1.9) で削除しました 49。 ゲノムの著しく濃縮された領域は、MACS ピーク コーラー (バージョン 2.1.1、オプション "-p 1e−5 --gsize mm --nomodel --extsize 160") を使用して特定されました50。

16～18週齢の雄マウスと13～18週齢の雌マウスに、PBSに溶解したKA(25mg/kg)を腹腔内注射した。 KA による発作の誘発は、側頭葉てんかんの最も一般的に研究されているモデルの 1 つです 52。 行動発作は注射後 1 時間観察され、前述の基準に従ってスコア化されました 53: ステージ 0、正常な行動。 ステージ 1、不動と硬直。 ステージ 2、頭の揺れ。 ステージ 3、前肢クローヌスと立ち上がり。 ステージ 4、継続的な立ち上がりと落下。 ステージ5、間代強直発作。 ステージ6、死亡。 その後、海馬を摘出し、遺伝子発現の分析のために液体窒素で急速冷凍し、-80 °C で保存しました。 発作段階 3 ～ 5 のマウスを遺伝子発現解析および ATAC-seq 解析に使用しました。

Chd8 CKOマウスまたは対照マウスを、12時間明期、12時間暗期サイクル（午前8時に点灯）で、餌と水を自由に摂取できる部屋で集団飼育した。 行動試験は、以前に記載されているように、生後 11 ～ 18 週の雄および雌のマウスを用いて、午前 9 時から午後 6 時までの間に実施されました 19。 嗅覚信号による偏りを防ぐために、各動物の試験前に各装置を希次亜塩素酸ナトリウム溶液で洗浄した。 行動テストには、モリス水迷路テスト、オープンフィールドテスト、明暗移行テスト、高架十字迷路テスト、セルフグルーミングテスト、新しい環境での社会的相互作用テスト、および社交性および社会的新規性選好テストが含まれます。 すべてのテストは、以下に説明する自動分析システムを使用して、よく訓練された実験者によって実行されました。 行動測定における偏りを排除するために、実験者には常にマウスの遺伝子型を知らされていませんでした。

モリス水迷路テストの可視および非表示のプラットフォーム試験では、円形のプラスチック プール (直径 120 cm) に、白色に着色した水 (21° ± 1.0 °C に維持) を深さ 30 cm まで満たしました。無毒な塗料の添加54。 透明な円形の脱出プラットフォーム (直径 9 cm) がプールの四分円の 1 つの中央に沈められ、その表面は水面より約 1 cm 低くなりました。 幾何学的な形と色の異なる視覚的手がかりがプールの周りに配布されました。 生後 11 ～ 15 週の雄マウスと生後 11 ～ 16 週の雌マウスに、まず、台に旗を付ける可視台課題を課しました。 翌日、旗は取り外され、隠されたプラットフォームのタスクが 4 日連続で実行されました。 マウスは、プール内の 4 つの象限のそれぞれの壁に面してランダムに配置されました。 各タスクは 1 日あたり 4 回の試行で構成され、カットオフ時間は 60 秒でした。 マウスがターゲットプラットフォームに到達した場合、マウスはプラットフォーム上に 15 秒以上留まることを許可されました。 マウスが 60 秒以内にプラットフォームを見つけられなかった場合は、マウスを静かにプラットフォームまで誘導し、その後 15 秒以上放置しました。 6日目に、プラットフォームをプールから取り出し、プラットフォームの以前の位置の記憶を評価するためにプローブトライアルを実行しました。 マウスをプールで 60 秒間泳がせ、各象限で費やした時間を測定しました。 マウスの移動はビデオカメラで記録され、SMART Video Tracking ソフトウェア (Panlab) で自動的に分析されました。

生後 14 ～ 16 週の雄マウスまたは生後 12 ～ 17 週の雌マウスを、照明を当てたオープンフィールド装置 (50 x 50 x 40 cm、O'Hara & Co.) の隅に置きました。 100ルクスで。 総移動距離と中央エリア (25 × 25 cm) で過ごした時間を 10 分間記録しました。 マウスの移動は、LabVIEWのカスタムメイドプログラムで制御されたビデオカメラで記録され、Pythonで書かれた社内ソフトウェアで自動的に分析されました。

この装置は、２つの開放アーム（２５×５ｃｍ）と、高さ１５ｃｍの透明な壁を備えた同じサイズの２つの密閉アーム（Ｏ'Ｈａｒａ ＆ Ｃｏ．）から構成されていた。 アームと中央の広場は白いプラスチック板でできており、床から 50 cm の高さに持ち上げられていました。 開いたアームに高さ 3 mm のプラスチック製の棚を設けることで、動物が装置から落ちる可能性を最小限に抑えました。 同じタイプのアームを反対側に配置しました。 生後 15 ～ 17 週の雄マウスまたは生後 12 ～ 17 週の雌マウスを、閉じたアームの 1 つに面した迷路の中央の正方形 (5 × 5 cm) に置き、その行動を 10 分間記録しました。 。 マウスの移動はLabVIEWのカスタムメイドプログラムで制御されたビデオカメラで記録され、オープンアームで費やされた時間はPythonで書かれた社内ソフトウェアで自動的に測定されました。

この装置は、ドア付きの仕切り（O'Hara & Co.）によって同じサイズの 2 つのセクションに分割されたケージ (21 x 42 x 25 cm) から構成されていました。 1 つのチャンバーは白いプラスチックでできており明るく (390 ルクス) 照明されていましたが、もう 1 つのチャンバーは黒くて暗い (2 ルクス) でした。 14～17週齢の雄マウスまたは12～17週齢の雌マウスを暗室に置き、ドアを開けたまま2つの部屋の間を10分間自由に移動させた。 マウスの移動はLabVIEWのカスタムメイドプログラムで制御されたビデオカメラで記録され、各チャンバー内で費やされた時間はPythonで書かれた社内ソフトウェアで自動的に測定されました。

グルーミングテストは前述のように実行されました12。 生後 11 ～ 16 週の雄マウスまたは生後 13 ～ 18 週の雌マウスをそれぞれ新しい標準ケージに入れました。 10分間の馴化後、動物を10分間の試験期間ビデオ撮影し、グルーミング行動に費やした時間を測定した。

雄で15〜17週齢、雌で12〜17週齢の、以前に混合遺伝子型のグループ（ケージあたり3匹または4匹の動物）および異なるケージに飼育されていた同じ遺伝子型の2匹のマウスを一緒に配置しました。箱（50×50×40cm、O'Hara & Co.）に入れて、10分間自由に探索させました。 画像は 1 秒あたり 3 フレームの速度でキャプチャされ、分析は Python で書かれた社内ソフトウェアで自動的に実行されました。 総接触回数と総接触時間を測定した。

試験装置は、長方形の 3 室の箱 (O'Hara & Co.) で構成されていました。 各チャンバーは 20 x 40 x 30 cm で、隔壁は透明なプレキシガラスでできており、各チャンバーへのアクセスを可能にする小さな開口部 (6 cm) がありました。 対象マウスと以前に接触したことのない、性別が一致した見慣れないマウス (見知らぬマウス 1) を側室の 1 つに入れました。 左室と右室における見知らぬ人 1 の位置は、試験間で体系的に交互に配置されました。 見知らぬネズミは小さな円形のワイヤーケージに入れられ、バーの間で鼻が接触することは許されましたが、争いは避けられました。 ケージの高さは１０ｃｍ、底部の直径は１０ｃｍ、垂直バーの間隔は０．５ｃｍであった。 同一の空のケージを反対側のチャンバーに配置しました。 被験者のマウスを最初に中央のチャンバーに置き、社会テストボックス全体を 10 分間探索させました。 各ケージの周囲と各部屋で費やした時間をカメラを使って測定し、見知らぬ 1 に対する社会的好みを定量化しました。次に、性別が一致した見慣れない 2 匹目のマウス (見知らぬ 2) を空のケージに入れました。 したがって、テストマウスは、最初のすでに調査された見慣れないマウス（見知らぬ人 1）と新しい見慣れないマウス（見知らぬ人 2）のどちらかを選択することになりました。 2 回目の 10 分間のセッション中に各ケージの周囲および各チャンバー内で費やした時間を、以前と同様に測定しました。 ストレンジャーマウスとしてC57BL/6Jマウスを使用し、これらの試験に使用した対象マウスは雄は16〜18週齢、雌は13〜17週齢であった。 マウスの移動は、LabVIEWのカスタムメイドプログラムで制御されたビデオカメラで記録され、Pythonで書かれた社内ソフトウェアで自動的に分析されました。

定量的データは、平均値±標準誤差として、または表示どおりに表示され、各実験に供されたマウスの数も記載されています。 R 言語を使用して、対応のないスチューデントの t 検定、対応のあるスチューデントの t 検定、テューキーの事後検定による一元配置分散分析 (ANOVA)、二元要因分散分析、または二元配置反復分散分析による統計分析を実行しました。 。 P および FDR q 値の有意水準は、<0.05、<0.01、<0.001、および <0.0001 に対してそれぞれ *、**、***、および **** で示されます。

すべてのグラフの基礎となるソース データは、補足データ 2 で入手できます。データは、対応する著者に連絡することで入手できます。 イムノブロットのトリミングされていない画像を補足図8に示します。RNA-seqおよびATAC-seqデータは、アクセッション番号DRA014131、DRA016165、およびDRA016198でDDBJシーケンスリードアーカイブ（DRA）に寄託されています。

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著者らは、全体的な技術支援について浅村 M.、小林 H.、および C. Tambo に感謝します。 A. 豊田氏（国立遺伝学研究所）、RNA-seq および ATAC-seq 解析に関する技術支援をしていただきました。 モリス水迷路テスト用の機器の使用については、K.小野、T.Hamaguchi、D.Muramatsu。 宮本 T. 全般的な支援とディスカッションに協力していただきました。 研究室のメンバーとディスカッションします。 AK は日本学術振興会 (JSPS) の特別研究員によって支援されました。 この研究の一部は、JSPS および日本の文部科学省から MN (JP21H02847 および 16H06279 (PAGS)) および AK (JP21K15726、JP21H05619、および 22H05493) への科研費によって支援されました。日本医療研究開発機構（AMED）からMNへのPRIME助成金によるもの（JP22gm6310008）。

金沢大学大学院医学系研究科組織細胞生物学分野（〒920-8640 石川県金沢市）

Atsuki Kawamura & Masaaki Nishiyama

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AK は実験を設計および実行し、データを分析し、原稿を準備しました。 MN は研究の監督と原稿の執筆に貢献しました。

Correspondence to Masaaki Nishiyama.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Konstantinos Zarbalis と他の匿名の査読者に感謝します。 主な編集者: Joao Valente。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Kawasaki, A.、Nishiyama, M. 自閉症関連遺伝子 Chd8 の欠失により、マウスの分裂終了ニューロンにおける活性依存性の転写応答が変化します。 Commun Biol 6、593 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04968-y

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受信日: 2022 年 6 月 17 日

受理日: 2023 年 5 月 23 日

公開日: 2023 年 6 月 2 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04968-y

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