オメガ

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 13、記事番号: 3013 (2022) この記事を引用

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肺高血圧症は、肺動脈抵抗の上昇によって右心不全を引き起こす、致死的なまれな病気です。肺血管リモデリングに焦点を当てた治療法の開発に対する医療上のニーズは満たされていません。血管周囲の炎症細胞によって産生される生理活性脂質は、血管のリモデリングを調節する可能性があります。今回我々は、酸化型リン脂質選択的ホスホリパーゼA2であるPAF-AH2によってマスト細胞から放出されるω-3脂肪酸由来のエポキシド（ω-3エポキシド）が肺高血圧症を負に制御することを示す。マウスにおける Pafah2 の遺伝子欠失は血管リモデリングを促進し、低酸素性肺高血圧症の悪化を引き起こします。 ω-3 エポキシドによる治療は、TGF-β シグナル伝達を阻害することにより肺線維芽細胞の活性化を抑制します。インビボでのω-3エポキシドの補給は、いくつかの動物モデルにおいて肺高血圧症の進行を軽減します。さらに、肺動脈性肺高血圧症患者の全エクソーム配列決定により、Pafah2 の 2 つの病原性変異候補が特定されました。我々の発見は、PAF-AH2-ω-3 エポキシド生成軸が肺高血圧症の有望な治療標的となり得ることを裏付けるものである。

肺動脈性肺高血圧症 (PAH) は、特発性肺動脈狭窄を引き起こし、肺動脈圧の上昇を引き起こし、この慢性的な圧過負荷により最終的には右心不全を引き起こし、死に至る致死的な稀な疾患です。肺高血圧症（PH）は、肺動脈内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞が関与する「肺血管リモデリング」として知られる不可逆的な組織変化を特徴とします1、2。 PH に利用可能な治療法は PAH3 患者の生存期間を著しく改善しましたが、患者のかなりの部分は期待される有効性を達成できません。したがって、肺血管リモデリングを抑制し、疾患の進行を軽減できる薬剤は、患者の生存期間を延ばす可能性がある満たされていない医療ニーズであると考えられています4。

炎症細胞は組織のリモデリングにおいて重要な役割を果たします。肺血管リモデリングでは、肺組織に存在する数種類の炎症細胞が、血管組織の変化を制御するサイトカインやケモカインなどの体液性因子を産生します1、2、5。さらに、脂質メディエーターも局所炎症細胞によって産生され、これらのメディエーターは炎症、血栓形成、血管新生、線維症を調節し、これらすべてが血管リモデリングを促進する可能性があります6,7。実際、プロスタノイドやロイコトリエンなどの炎症促進性機能性脂質が PH8、9、10 の病因に寄与していることが示されています。一方、主にエイコサペンタエン酸 (EPA) とドコサヘキサエン酸 (DHA) であるω-3 脂肪酸は生体保護の役割を果たすことが知られており、その誘導体の一部は組織リモデリングを抑制する独特の機能を有することが報告されています 6 、11、12、13。我々の以前の報告では、圧力過負荷誘発性心臓リモデリングモデルを使用して、マクロファージによって放出されるEPA代謝産物が心臓線維芽細胞の異常な活性化を抑制し、組織の恒常性を維持することを実証しました14。したがって、ω-3 脂肪酸およびその誘導体も PH における肺血管リモデリングを抑制すると予想されますが、これについてはまだ解明されていません。

今回、PH肺サンプルの包括的なリピドーム解析と、膜リン脂質からのω-3エポキシド生成酵素であるII型血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼ（PAF-AH2）のノックアウト（KO）マウスの表現型解析により、以下のことを明らかにした。エポキシ化されたω-3 脂肪酸は、PH の発症に関与する機能性脂質メディエーターとして 3 員環エーテル (ω-3 エポキシド; 17,18-EpETE および 19,20-EpDPE) を持っています。オメガ-3 エポキシドは、外膜線維芽細胞の異常な活性化を抑制するために肺のマスト細胞から常に産生されており、外部から投与された場合でも PH に対して治療効果を示しました。また、現在の治療法に対する反応が不十分な PAH 患者において PAF-AH2 の病原性変異も発見し、ω-3 エポキシドが PAH の貴重な治療標的である可能性があることを示唆しました。

PH 肺で特徴的に変化した貴重な機能性脂質を同定するために、液体クロマトグラフィータンデム質量分析 (LC-MS/MS) を使用して包括的なリピドミクス分析を実行し、肺組織中の EPA、DHA、およびアラキドン酸 (AA) 代謝産物を測定しました。慢性低酸素症（酸素濃度10％）によりPHが誘発されたマウス。低酸素肺の組織では、ω-3 エポキシドである 17,18-EpETE および 19,20-EpDPE、およびその不活性ジヒドロジオールである 17,18-diHETE および 19,20-diHDoPE のレベルが減少していることがわかりました（図 2）。 1a〜c、補足図1a〜e）。これらの結果に対応して、ホスホリパーゼ A2 ファミリーに属し、ω-3 エポキシドを含む膜リン脂質を優先的に加水分解して ω-3 エポキシドを遊離する重要な酵素である PAF-AH2 の発現も、低酸素肺の組織では大幅に減少しました。図2a)。

a、b 正常酸素状態または低酸素状態（10% O2）に 4、14、および 28 日間曝露された WT マウスの肺の LC-MS/MS ベースのリピドミクスにおけるオメガ-3 脂肪酸代謝物。 a EPA 代謝物、b DHA 代謝物。 Z スコアは各グループ (n = 3) の平均値から計算され、ヒートマップとして表示されました。 c 肺の LC-MS/MS ベースのリピドミクスによって評価された、ω-3 エポキシド (17,18-EpETE および 19,20-EpDPE) およびそのジヒドロジオール (17,18-diHETE および 19,20-diHDoPE) の含有量WT マウスを正常酸素状態または低酸素状態に 4、14、および 28 日間曝露した (n = 3)。データは平均値 ± SEM です。 P 値は、ダネットの事後検定を使用した一元配置分散分析によって決定されました。

8週間正常酸素状態または低酸素状態に曝露されたWTマウスおよびPafah2 KOマウスの肺からの総タンパク質中のPAF-AH2のウェスタンブロッティング(左)および濃度測定による定量(右)。実験は 3 回繰り返され、データがプールされました。 b 8週間低酸素に曝露されたWTマウスおよびPafah2 KOマウスの肺のLC-MS/MSベースのリピドミクスによって評価されたω-3エポキシドの含有量（n = 4,5）。 c 8週間正常酸素状態または低酸素状態に曝露されたWT、Pafah2 KO、およびPla2g7 KOマウスの肺のHE染色（上）およびEVG染色（下）による組織切片の代表的な画像。スケールバー、50μm。 d – f 正常酸素状態または低酸素状態に8週間曝露されたWT、Pafah2 KO、およびPla2g7 KOマウスのPH重症度の評価（正常酸素状態、n = 4、4、4;低酸素状態、n = 6、8、6）。肺細動脈の壁の厚さ (d)、RVSP (e)、LV + 中隔に対する RV の重量比 (f)。実験は 2 回繰り返され、データがプールされました (e、f)。 g 低酸素曝露WTマウスおよびPafah2 KOマウスのRVにおけるNppaの相対mRNAレベル（n = 6、8）。発現レベルは、18S リボソーム RNA の発現レベルに対して正規化され、次に WT マウスの RV の発現レベルに対して正規化されました。 h 100日までの低酸素曝露WT、Pafah2 KO、およびPla2g7 KOマウスのカプラン・マイヤー曲線（n = 16）。ログランクテスト。 WT 対 Pafah2 KO、P = 0.002、Pafah2 KO 対 Pla2g7 KO、P = 0.011。実験は 3 回繰り返され、データがプールされました。 i 8週間正常酸素状態または低酸素状態に曝露されたWTマウスおよびPafah2 KOマウスの肺におけるCol1a1の相対mRNAレベル（n = 6）。発現レベルは、18S リボソーム RNA の発現レベルに対して正規化され、次に WT マウスの肺の発現レベルに対して正規化されました。 j 8週間低酸素状態に曝露されたWTマウスおよびPafah2 KOマウスの肺におけるビメンチンおよびCD31の免疫組織化学の代表的な画像。核はDAPIで標識されました。スケールバー、50μm。データは平均値 ± SEM です。 P 値は、ボンフェローニの事後検定を使用した二元配置分散分析 (a)、テューキーの事後検定を使用した一元配置分散分析 (d-f)、または両側スチューデント T 検定 (b、g、i) によって決定されました。

PHの発症におけるω-3エポキシドの重要性を決定するために、慢性低酸素状態(8週間)にさらされたPAF-AH2欠損マウスの表現型を調査した。 Pafah2 KOマウスは、野生型（WT）マウスと比較して、低酸素条件下で肺内で生成するω-3エポキシド、特に17,18-EpETEおよび19,20-EpDPEの量が低かった（図2b、補足図2a）。）。組織学的分析により、PHを有するPafah2 KOマウスは、肺動脈壁の肥厚や重度の血管周囲線維症などの高度な肺血管リモデリングを示したことが明らかになりました（図2c、d）。これらの所見と一致して、Pafah2 KOマウスは心臓カテーテル検査中にWTマウスよりも高い右室収縮期圧（RVSP）を示し、それによってPHの重症度の増加を示しました（図2e）。さらに、低酸素性PHのPafah2 KOマウスは、右心室（RV）肥大の増加（図2f）やRV内の心不全マーカーであるNppaのmRNAレベルの上昇（図2g）など、進行性の右心不全を示しました。低酸素曝露後100日以内の死亡率はほぼ80％と高い（図2h）。 PHマウスモデルに対する性別の影響を評価しましたが、Pafah2 KOマウスの低酸素性PHの重症度と増悪したPHの表現型には差異は観察されませんでした（補足図3a〜d）。 Pafah2 KO マウスの低酸素誘発肺血管リモデリングは、Col1a1 mRNA レベルの上昇と肺血管内のビメンチン陽性領域によって示されるように、重度の血管周囲線維症を特徴としていました（図 2i、j）。さらに、本発明者らは、血漿型PAF-AH KOマウス（Pla2g7 KO）を用いてPHの表現型を評価した。このマウスは、PAF-AH216,17と同様のPAF-アセチルヒドロラーゼ酵素活性を有する酵素であるが、PHに重篤な変化は見られなかった。観察されました（図2c〜f、h）。これらの発見は、PAF-AH2 に特有の脂質代謝産物、たとえば ω-3 エポキシドが PH の進行に主要な役割を果たしていることを示唆しています。

次に、肺でのω-3エポキシドの生成に関与する細胞の種類を特定しました。低酸素PHマウスモデル、Sugen/低酸素PHマウスモデル、ヒト特発性PAH患者の肺サンプルの蛍光免疫組織化学により、PAF-AH2を発現する細胞はトリプターゼ陽性マスト細胞であるが、マクロファージ、線維芽細胞、内皮細胞、呼吸器細胞ではないことが明らかになった。上皮細胞（図3a、補足図4a、b）。以前の報告18、19の所見と一致して、マスト細胞はPH肺の肺血管の周囲に蓄積することが判明した（図3b）。

PH マウスまたは PAH 患者の肺における PAF-AH2、トリプターゼおよび CD31 の免疫染色の代表的な画像。 SuHx; スーゲン/低酸素症。スケールバー、50μm。 b PH マウス、PH ラット、または PAH 患者の肺切片のトルイジンブルー染色の代表的な画像。矢印はトルイジンブルー陽性の肥満細胞を示します。 V 血管内腔、MCT モノクロタリン。スケールバー、50μm。 c PHを施したBMMCで再構成されたKit W-sh/W-shマウスの概略図。 RHC右心カテーテル検査。 d 4週間の低酸素曝露後のWT BMMC（WT→W-sh）またはPafah2 KO BMMC（Pafah2 KO→W-sh）で再構成されたKit W-sh / W-sh マウスの肺細動脈のEVG染色の代表的な画像。スケールバー、50μm。 e – g 低酸素に曝露されたBMMC再構成Kit W-sh/W-shマウスのPH重症度の評価（n = 5、7）。肺細動脈の壁の厚さ (e)、RVSP (f)、LV + 中隔に対する RV の重量比 (g)。実験は 2 回繰り返され、データがプールされました (f、g)。低酸素に曝露されたBMMC再構成Kit W-sh/W-shマウスのRVにおけるNppa（h）および肺におけるCol1a1（i）の相対mRNAレベル。 (n = 4,5)。発現レベルは、18S リボソーム RNA の発現レベルに対して正規化され、次に WT → W-sh マウスの RV または肺の発現レベルに対して正規化されました。データは平均値 ± SEM です。 P 値は、両側スチューデント T 検定によって決定されました。

PAF-AH2 発現マスト細胞が Pafah2 KO マウスに見られる重度の PH 表現型に寄与しているかどうかを調べるために、マスト細胞欠損マウス (Kit W-sh/W-sh) を用意し、骨髄由来マスト細胞 (BMMC) で再構成しました。）WTマウスまたはPafah2 KOマウスから。次に、これらのマウスを低酸素状態に 4 週間曝露しました (図 3c)。 BMMC注射の4週間後、再構成マウスの肺で十分な数のトリプターゼ陽性、PAF-AH2陽性肥満細胞を確認できました（補足図4c、d）。予想どおり、Pafah2 KO BMMCで再構成されたKit W-sh / W-sh マウスは、WT BMMCで再構成されたものと比較して重度のPH表現型を示し（図3d–i）、マストにおけるPAF-AH2活性の欠如を示唆しています細胞は、低酸素条件下での Pafah2 KO マウスの表現型に関与していました。

オメガ-3 エポキシドは、マスト細胞における IgE 依存性の脱顆粒を促進することが知られています 15。我々は、低酸素によるマスト細胞の脱顆粒が、生体内でのPAF-AH2の存在または不在によって影響を受けるかどうかを調べた。低酸素は肺のマスト細胞を増加させ、その脱顆粒をわずかに増加させましたが、肺のマスト細胞の総数と脱顆粒速度は、正常酸素下でも低酸素下でもWTマウスとPafah2 KOマウスの間に有意差を示しませんでした（補足図1）。 5a、b)。さらに、インビトロでのβ-HEX放出によって評価されたBMMCの低酸素依存性脱顆粒は、WT BMMCとPafah2 KO BMMCの間でほぼ同等でした（補足図5c）。

インビボでPAF-AH2の非存在下でマスト細胞の脱顆粒が低酸素性PHの悪化を媒介するかどうかを調べるために、脱顆粒を阻害するマスト細胞安定剤であるケトチフェンを投与したときのPafah2 KOマウスの低酸素性PHの改善を評価しました。。ケトチフェンは肺の低酸素依存性マスト細胞の脱顆粒を有意に抑制しましたが（補足図5d）、Pafah2 KOマウスはケトチフェン治療に関係なく重度のPHを示しました（補足図5e-g）。これは、マスト細胞の脱顆粒がPAF-AH2の欠如によって誘発される重篤なPHの根底にあるメカニズムには関与していません。

マスト細胞は、IgE 抗原刺激とは無関係に、静止状態でも ω-3 エポキシドを分泌するため 15、我々は、マスト細胞からの ω-3 エポキシドが傍分泌的に肺動脈の構成細胞、特に血管周囲線維芽細胞に作用し、制御しているのではないかという仮説を立てました。これらは、低酸素に曝露されたPafah2 KOマウスで顕著に活性化されました（図2i、j）。マスト細胞によって放出される脂質の肺線維芽細胞への影響を調べるために、BMMC の培養上清から単離した遊離脂肪酸画分の脂質抽出物を初代培養マウス肺線維芽細胞に添加しました。 Pafah2 KO BMMC からの脂質抽出物は、WT BMMC の上清と比較して、線維芽細胞の増殖および Col1a1 および Acta2 などの線維芽細胞活性化マーカーの mRNA 発現を増加させました。 ω-3エポキシドによる追加処理は、Pafah2 KO BMMCからの脂質抽出物で刺激された線維芽細胞における活性化マーカー遺伝子の異常な増殖と上方制御を抑制しました（図4a、補足図6a）。肺線維芽細胞の増殖は、ω-3エポキシド、17,18-EpETEまたは19,20-EpDPEによる処理によって抑制されましたが、EPA、DHA、またはそれらのジヒドロジオールによっては抑制されませんでした（図4b、補足図6b）。組織線維化およびPAH1,20の病態生理学に密接に関連するTGF-βシグナル伝達に焦点を当て、肺線維芽細胞に対するω-3エポキシドの有効性を評価しました。 ω-3エポキシドの処理は、TGF-β刺激条件下の肺線維芽細胞におけるCol1a1、Acta2、およびIl6のmRNA発現（図4c）および筋線維芽細胞マーカーであるSM22αの発現を有意に抑制した（図4d）。これにより、ω-3 エポキシドが線維芽細胞の活性化を抑制したことが示されました。さらに、ω-3エポキシドは肺線維芽細胞の移動に対して阻害効果も示しました（補足図6c）。他のエポキシ化脂肪酸である14,15-EETを含むω-6エポキシドは、TGF-β活性化肺線維芽細胞に対する阻害効果を示さなかった（補足図7a、b）。 ω-3エポキシドがTGF-βシグナル伝達経路の上流基質であるSmad2のリン酸化を阻害することが確認され、この経路が作用機序の1つであることが示唆された（図4e）。

a ω-3エポキシド（1μM）の有無にかかわらず48時間処理した場合に、BMMCの培養培地からの脂質抽出物によって刺激された肺線維芽細胞の相対数（n = 4）。データは 2 つの独立した実験反復を表しています。 b ビヒクル、17,18-EpETE (1 μM)、17,18-diHETE (1 μM)、19,20-EpDPE (1 μM)、19,20-diHDoPE (1 μM)、 EPA (1 μM) または DHA (1 μM) を 48 時間投与 (n = 4)。データは 3 回の独立した実験反復の代表です。 c TGF-βの有無にかかわらず刺激した場合の、ビヒクル、17,18-EpETE（1μM）、または19,20-EpDPE（1μM）で6時間処理した肺線維芽細胞におけるCol1a1、Acta2、およびIl6 mRNAの相対発現レベル(2.5 ng/ml) (n = 4)。発現レベルは、18S リボソーム RNA の発現レベルに対して正規化され、次に刺激されていない対照線維芽細胞の発現レベルに対して正規化されました。データは 3 回の独立した実験反復の代表です。 d ビヒクル、17,18-EpETE（1μM）、19,20-EpDPE（1μM）、EPA（1μM）、またはDHA（1μM）で24時間処理した肺線維芽細胞におけるSM22αの免疫染色。 TGF-β (2.5 ng/ml) なし (左)。スケールバー、50μm。肺線維芽細胞全体に対する SM22α 陽性細胞の比率 (右) (n = 4)。データは 2 つの独立した実験反復を表しています。 e TGF-β刺激の有無にかかわらず、ビヒクル、17,18-EpETE（1μM）、または19,20-EpDPE（1μM）を投与した場合の、肺線維芽細胞からの総タンパク質抽出物中のpSmad2、Smad2、およびβ-アクチンのウェスタンブロッティング(1 ng/ml および 2.5 ng/ml) で 15 分間 (左)、デンシトメトリーによる定量 (右)。実験は 3 回繰り返され、データがプールされました。データは平均値 ± SEM です。 P 値は、ダネットの事後テストを使用した一元配置分散分析 (a ～ d) またはテューキーの事後テストを使用した二元配置分散分析 (e) によって決定されました。

これまでの研究により、肺動脈の内皮細胞および平滑筋細胞の異常が PAH1、2 の発症に大きく関与していることが実証されています。ただし、ω-3エポキシドは、肺動脈内皮細胞におけるPAHの病態生理学に関連する遺伝子発現には影響を与えず（補足図8a）、酸化損傷から保護するために内皮細胞に抗酸化効果を発揮しませんでした（補足図8b、c）。）。さらに、肺動脈平滑筋細胞の増殖は、BMMCからの脂質抽出物（補足図8d）またはω-3エポキシド（補足図8e）による処理の影響を受けませんでした。

我々はまた、マスト細胞におけるPAF-AH2の発現を調節する機構を評価した。インビボの低酸素肺で見られたように（図2a）、インビトロで低酸素下で培養した場合、BMMCでもPafah2発現が下方制御されました（補足図9a）が、BMMCでは、ω-3エポキシ化21に関与する酵素であるCyp4a12の発現が減少しました。は変化しませんでした（補足図9a）。低酸素誘導因子（HIF）の活性化因子であるジメチルオキサリルグリシン（DMOG）またはCoCl2を投与すると、BMMCにおけるPafah2の発現が減少し（補足図9b）、PAF-AH2がHIFによって調節されることを示唆しています。

我々は、PAHに対するω-3エポキシドの治療可能性を検証しました。慢性低酸素症PHマウスモデルでは、低酸素曝露の2週間後に、19,20-EpDPEを毎日腹腔内注射により0.05 mg/kg/日の用量で投与した。 19,20-EpDPEの投与は、WTマウスとPafah2 KOマウスの両方において血管周囲線維症を含む高度な肺血管リモデリングを抑制することによりPHを有意に改善したが、DHAまたはω-6エポキシド、14,15-EETは有益な効果を示さなかった。 (図5a〜d、補足図10a〜d)。

PBS、DHA (0.05 mg/kg/日)、または 19,20-EpDPE を投与した場合の、低酸素曝露 WT マウスおよび Pafah2 KO マウスの肺における EVG 染色 (上) およびビメンチンおよび CD31 の免疫染色 (下) の代表的な画像(0.05 mg/kg/日) 毎日腹腔内投与。これらの投与は、低酸素曝露の２週間後に開始した。スケールバー、50μm。 b – d PBS、DHA、または19,20-EpDPEを投与した場合の低酸素曝露WTマウスおよびPafah2 KOマウスにおけるPH重症度の評価（WTマウス、n = 6、6、7; Pafah2 KOマウス、n = 7、 6,7)。肺細動脈の壁の厚さ (b)、RVSP (c)、LV と LV + 中隔の重量比 (d)。実験は 2 回繰り返され、データがプールされました (c、d)。 e ビヒクル、DHA (0.05 mg/kg/日)、または19,20-EpDPE (0.05 mg)を投与した場合のSugen/低酸素処置WTマウスの肺におけるEVG染色(上)およびビメンチンおよびCD31の免疫染色(下)の代表的な画像/kg/日) 毎日ip。これらの投与は、低酸素曝露の３週間後に開始した。スケールバー、50μm。 f – h PBS、DHA、または19,20-EpDPEを投与した場合のSugen/低酸素治療WTマウスのPH重症度の評価（n = 6、5、6）。肺細動脈の壁の厚さ (f)、RVSP (g)、LV + 中隔に対する RV の重量比 (h)。データは平均値 ± SEM です。 P 値は、ダネットの事後検定を使用した一元配置分散分析によって決定されました。

さらに、より重篤な PH 表現型を示した Sugen/低酸素症 PH マウスモデルにおけるω-3 エポキシドの有効性を評価しました。慢性低酸素PHモデルで観察されたように、DHAではなく19,20-EpDPEの投与は、Sugen/低酸素マウスのPHの重症度を軽減しました（図5e〜h）。これらの結果は、生体内でのω-3エポキシドの補給がPHの実行可能な治療法である可能性があることを示しています。

PAF-AH2の異常がヒトPAHの発症に関与しているかどうかを調べるために、全エクソームシーケンスを使用してPH患者のPafah2の病的バリアントを検索しました。特発性 PAH 90 名、遺伝性 PAH 61 名、結合組織病関連 PAH 54 名を含む 262 名の患者からの血液サンプルを分析しました（補足表 1）。われわれは、Pafah2 の 2 つの重要な変異体、p.Arg85Cys (R85C)/c.253C>T および p.Gln184Arg (Q184R)/c.551A>G を発見しました。これらは、3 人の PAH 患者から高病原性であると推定されています (補足表 2)。。これらの SNP は、高い病原性を示す複合アノテーション依存性枯渇 (CADD) スコアが高かった。また、これらの変異体は、Pafah2の触媒部位とは異なる部位で見つかりました（図6a）。 PAF-AH2タンパク質の相同性モデルを初期モデルとして使用すると、シミュレートされたPAF-AH2 p.R85CおよびPAF-AH2 p.Q184R変異体は、天然タンパク質と比較して構造変化があることが示されました（図6b）。さらに、本発明者らは、ｉｎｖｉｔｒｏでｐｃＤＮＡベクターを使用して変異タンパク質を発現させることにより、Ｐａｆａｈ２変異体の影響を調べた。変異タンパク質、PAF-AH2 p.R85C および p.Q184R のレベルは、天然の PAF-AH2 のレベルと比較して大幅に減少しましたが、触媒部位の変異体である PAF-AH2 S236C のレベルは変化していませんでした。図6c)。興味深いことに、プロテアソーム阻害剤であるMG132で処理すると、PAF-AH2 p.R85Cおよびp.Q184Rのタンパク質レベルが部分的に回復し（図6c）、タンパク質の分解がユビキチンプロテアソームシステムによるものであることが示唆されました。総合すると、PAH 患者に見られる Pafah2 p.R85C および p.Q184R 変異体は、PAF-AH2 タンパク質の分解に対する脆弱性を高めることにより、PH の進行に寄与していると考えられました。

a ヒト Pafah2 遺伝子における 2 つの病原性変異候補の位置を示す概略図。 b PAF-AH2 p.R85C バリアント (左の黄色)、p.Q184R バリアント (右の黄色)、およびネイティブ型 (青) の構造モデル。フレーム 2700 ～ 3000 ( 54 ～ 60 ナノ秒）。矢印は、ネイティブ形式モデルと比較して、各バリアントモデルで変化した構造を示します。 c MG132（10μM）の存在下または非存在下で6時間処理した場合のpcDNAベクターを使用した、ヒトPafah2変異体を発現するHEK 293細胞におけるPAF-AH2のウェスタンブロット（上）、および濃度測定による定量（下）。実験は 4 回繰り返され、データがプールされました。 d グラフによる概要。データは平均値 ± SEM です。 P 値は、Tukey の事後検定を使用した二元配置分散分析によって決定されました。

この研究では、ω-3 エポキシドが肺動脈の血管リモデリングの制御を通じて PH の発症に対抗することを実証しました。これは、(a)肺組織内のω-3エポキシドはPHの進行とともに減少する、(b)ω-3エポキシド生成酵素であるPAF-AH2を欠損するマウスではPHが悪化する、および( c) ω-3 エポキシドの補給により、いくつかの疾患モデルにおいて PH の重症度が軽減されました。

3 員環エーテルを持つエポキシ化脂肪酸は、反応性の高い脂質です。たとえば、アラキドン酸由来のエポキシ化脂肪酸 (エポキシエイコサノイド、EET) には、血管新生や抗炎症などのさまざまなプロセスに影響を与えるいくつかの機能があり、恒常性の維持に貢献します 22,23,24。一方、ω-3 脂肪酸は心臓保護などの生体防御作用があることが知られており 25,26,27、近年そのエポキシ化合物が抗炎症作用、血管拡張作用、腫瘍抑制作用などの独特の強力な生理作用を発揮することが明らかになってきています。 -抑制効果28、29、30、31、32、33、34。興味深いことに、この研究で観察されたω-3 エポキシドによって発揮される抗線維化作用と PH の改善は、ω-3 脂肪酸 (EPA および DHA) を同じ用量で投与した場合には確認できず、これらの機能が特異的であることを示唆しています。 ω-3エポキシド。それらの作用点はこれまでのところ詳細に明確には特定されていないが、ω-3 エポキシドである 19, 20-EpDPE が Smad2 のリン酸化を有意に抑制することから、TGF-β シグナル伝達経路が根底にあるメカニズムに関与している可能性がある。肺線維芽細胞の TGF-β によって刺激されます。

プラズマ型 PAF-AH と PAF-AH2 の基質選択性は類似しています 16。 PAF に加えて、両方の PAF-AH は、短いおよび/または酸化された sn-2 脂肪アシル鎖を持つリン脂質を加水分解できますが、2 つの長い脂肪アシル鎖を持つリン脂質はほとんど加水分解しません。最近、両方の PAF-AH が、F2-イソプロスタン含有リン脂質などの非断片化酸化リン脂質をゆっくりと加水分解できることが明らかになってきました。さらに、血漿型PAF-AHはリン脂質ヒドロペルオキシドも加水分解します。一方、最近、PAF-AH2 がリン脂質から ω-3 エポキシドを遊離する独特の活性を持っていることが示されました 15。 Pla2g7 KO マウスの低酸素性 PH の重症度を評価しましたが、WT マウスとの有意差は観察されませんでした。したがって、我々は、低酸素性PHの悪化した表現型がPafah2 KOマウスに特異的であり、PAF-AH2によって産生されるω-3エポキシドがPHの重症度と密接に関連していることを決定した。低酸素性PHにおける血漿型PAF-AHの役割はこれまで報告されておらず、比較的未知のままである。この研究では、低酸素性PHのPla2g7 KOマウスの生存率は有意ではありませんが、低酸素性PHの対照マウスよりも悪く（図2h）、血漿型PAF-AHが低酸素性PHまたは低酸素症に対する脆弱性に寄与している可能性があることを示唆しています自体。

細胞型特異性も 2 つの酵素間で異なります。血漿型 PAF-AH は、単球、マクロファージ、および T リンパ球によって分泌され、主にアテローム性動脈硬化斑のマクロファージが豊富な領域で発現されます 35。対照的に、PAF-AH2 は肝細胞、尿細管上皮細胞で発現され、マスト細胞で高度に発現されます 36。マスト細胞にはかなりの量の PAF-AH2 が含まれており、この酵素がマスト細胞の機能に必須であることが示唆されています。島中ら。らは、PAF-AH2 によって生成される ω-3 エポキシドが肥満細胞の脱顆粒を促進し、アレルギー性炎症において主要な役割を果たすことを実証しました 15。一方、我々の研究では、肥満細胞由来のω-3エポキシドが、低酸素状態にさらされた肺において生体保護の役割を果たすことが示された。さらに、島中ら。は、ω-3 エポキシドがマスト細胞内で作用することを報告しました 15。一方、私たちの研究では、それらは細胞から放出され、周囲の他の細胞に作用しました。実際、BMMCの培養上清中にはω-3エポキシドが検出されたことから、マスト細胞がω-3エポキシドを細胞外空間に放出したと考えられる。興味深いことに、マスト細胞は低酸素にさらされた場合でもわずかに脱顆粒することが知られています 37 が、WT BMMC と Pafah2 KO BMMC では有意差は観察されず、したがって、ω-3 エポキシドが低酸素誘発性の IgE 非依存性脱顆粒に影響を及ぼさないことが示されました。。

肥満細胞は主要な肺炎症細胞であり、喘息などのアレルギー反応と密接に関連しているため、肺に広く存在します 38。マスト細胞は PH の病因に関与していることが報告されており、マスト細胞の脱顆粒は炎症を促進し、PH18、19、39、40 を悪化させると考えられています。しかし、マスト細胞は抗炎症特性も持っていることが知られています 41,42。したがって、マスト細胞欠損マウスを使用した研究では、マスト細胞がPHにとって有益であるか有害であるかはまだ決定されていません。私たちの研究では、マスト細胞の脱顆粒の抑制剤であるケトチフェンの投与は、マウスの低酸素性PHの重症度に影響を与えませんでした。したがって、この研究の条件下では、マスト細胞は脱顆粒によって病態を悪化させるのではなく、むしろω-3エポキシドを放出することによってPHの進行を抑制した。

近年、PH のいくつかの動物モデルが開発されており、各モデルの限界を理解する必要があります。低酸素のみによって引き起こされる PH モデルは、グループ I PH (PAH) よりもグループ III PH (肺疾患および/または低酸素による PH) として分類するのが適切である可能性があります。本研究では、遺伝子改変マウスを用いて特定の分子とPHの病態生理との関係を明らかにするために、まず低酸素刺激のみを行ったシングルヒットモデルを使用した。低酸素性 PH モデルの実験結果は、PH の根底にある共通のメカニズムを部分的に説明できる可能性があります。ただし、重症度および組織変化がグループ I PH と同様である動物モデルも使用する必要がありました。 PAHにおけるPAF-AH2-ω-3エポキシド軸の重要性と有効性を実証するために、本研究ではω-3エポキシドをSugen/低酸素症PHマウスに投与する実験を実施した。

PH における血管リモデリングは、主に血管内皮細胞と平滑筋細胞の異常によって引き起こされると考えられています。しかし、低酸素性PHを有するPafah2 KOマウスは顕著な血管周囲線維症を示し、線維症がPHの増悪に強く影響したことが示唆された。興味深いことに、ω-3 エポキシドは、インビトロで肺動脈内皮細胞および平滑筋細胞の遺伝子発現および細胞増殖を有意に変化させなかった。さらに、周囲にω-3エポキシドを放出するマスト細胞は血管周囲の間質腔に局在しており、血管周囲線維芽細胞がω-3エポキシドの標的であることが示唆された。

この研究では、PAH患者の全エクソーム配列データから予測プログラム（CADDスコア>30、SIFT、有害、ポリフェン、おそらく有害）を使用して、PHの病原性に密接に関連するミスセンス変異を特定しました。これらの変異を持つ患者のほとんどは、既存の治療薬、主に血管拡張薬に対する反応が不十分でした。さらに、培養細胞で発現ベクターを使用した実験では、2 つの変異に関連して発現タンパク質レベルが低下していることが明らかになりました。 BMMCにおけるPAF-AH2の強制発現は、プラスミドベクターを用いて試みられたが、成功しなかった。そこで、プラスミドベクターの導入により十分な量の目的タンパク質を産生し、内在性のPAF-AH2タンパク質の産生が低いヒト由来の細胞であるHEK293細胞を導入細胞として選択した。プロテアソーム阻害剤で処理すると変異タンパク質のレベルが回復するため、ユビキチン化などの翻訳後修飾が変異による減少に関与していると考えられます。将来的には、これらの変異を有するヒトPAF-AH2のノックインマウスを作製して、PHが自然に発症するのか、それとも増悪を示すのかを判定する必要がある。

PH の主な治療には、プロスタグランジン I2、一酸化窒素、ホスホジエステラーゼ 5 阻害などのさまざまな治療薬による機能的血管拡張が含まれます。しかし、PH の進行を抑制できる根本的な疾患修飾薬はありません。肥満細胞などの炎症細胞が関与する肺動脈リモデリングは、PH の基礎となる重要なメカニズムと考えられています。この研究では、肺のマスト細胞によって産生されるω-3エポキシドが、肺血管リモデリングを抑制する効果的な治療薬の候補であることを明らかにしました。将来的には、肺動脈拡張薬では効果的な治療ができないPAF-AH2変異を有するPAH患者における肺血管リモデリングを抑制する目的で、ω-3エポキシドを用いた価値ある治療法の開発を目指したいと考えています。

本研究のすべての手順は、米国国立衛生研究所（NIH）が発行する実験動物の管理と使用に関するガイドに概説されている原則に準拠しており、慶応義塾大学医学部実験動物センターによって承認されました（No. D2012）。 -021およびNo.15063）。

Pafah2 KO マウスは、10 世代以上にわたって C57BL/6 マウスに戻し交配されました 36。 Pla2g7 KO マウス (C57BL/6J バックグラウンド) は、Stafforini 博士 (ユタ大学) のご厚意により提供されました。補足図3のものを除くすべての実験には雄のマウスを使用しました。KOマウス（7〜10週）を使用したすべての実験では、年齢と性別が一致したC57BL / 6Jマウスが対照として使用されました。マスト細胞欠損 Kit 変異マウス (C57BL/6J-Kit W-sh/W-sh) は、Jackson Laboratories から購入しました。すべてのマウスは、慶応義塾大学内の標準実験食（CE2; 日本クレア株式会社）と水を自由に摂取できる、環境制御（23℃）された特定病原体のない施設で12時間の明暗サイクルで飼育されました。

EPA、DHA、AA、17,18-EpETE、19,20-EpDPE、17,18-diHETE、19,20-diHDoPE、14,15-EET、およびその他の脂肪酸代謝産物は、Cayman Chemical から入手しました。

マウスの右肺組織を採取し、直ちに液体窒素中に入れた。サンプルを凍結粉砕した後、Bligh and Dyer43 の方法により脂質を抽出しました。抽出液を遠心エバポレーターで乾燥し、メタノール：イソプロパノール＝１：１に溶解し、−２０℃で保存した。脂肪酸代謝産物は、InertSep NH2 カラム (GL Science) と重水素標識内部標準 (11(12)-EET-d11) を使用した固相抽出によって組織からさらに精製されました。簡単に説明すると、InertSep NH2 カラムを 6 ml のヘキサンで前処理し、Bligh and Dyer の方法によって組織から抽出した脂質を 500 μL のクロロホルムに適用しました。次いで、カラムを６ｍｌのクロロホルム／イソプロパノール（２／１、ｖ／ｖ）で洗浄し、続いてジエチルエーテル／酢酸（９８／２、ｖ／ｖ）で溶出した。抽出液は遠心エバポレーターで乾燥し、メタノール：イソプロパノール＝１：１に溶解し、−２０℃で保存した44。

脂肪酸代謝産物の検出では、LC/ESI-MS ベースのリピドミクス分析を、QTRAP 4500 ハイブリッドトリプル四重極線形イオントラップ質量分析計 (AB SCIEX) と組み合わせた Shimadzu Nexera UPLC システム (島津製作所) で実行しました。クロマトグラフィーによる分離は、40 °C に維持した ACQUITY UPLC HSS T3 カラム (2.1 × 100 mm、1.8 µm、Waters) で移動相 A (10 mM 酢酸アンモニウムを含む水/酢酸 (100/0.1、v/v)) を使用して実行しました。 ) および移動相 B (10 mM 酢酸アンモニウムを含むアセトニトリル/メタノール (4/1、v/v)) によるグラジエントプログラム (0 ～ 2 分: 90% A、2 ～ 10 分: 90% A → 30% A) ; 10 ～ 24 分: 30% A → 27% A; 24 ～ 27 分: 1% A; 27 ～ 32 分: 90% A)、流速 0.2 ml/分 (0 ～ 10 分)、0.1 ml /分 (10 ～ 15 分)、0.2 ml/分 (15 ～ 24 分)、0.5 ml/分 (24 ～ 32 分)。機器パラメータは次のとおりです。カーテンガス、10 psi。イオンスプレー電圧、-4500 V。温度、600℃。イオンソースガス 1,70 psi; イオンソースガス 2、80 psi。特異的検出は、前述のように MRM によって実行されました 15,44。

慢性低酸素マウスモデルでは、低酸素空気発生装置（TEIJIN）を使用して維持された低酸素チャンバー（10％O2）にマウスを収容し、O2分析装置（JIKO-255）で4週間または8週間モニタリングしました。 Sugen/低酸素マウスモデルは、以前の報告に従って作成されました45。簡単に説明すると、20 mg/kg の VEGF 阻害剤 Sugen (SU5416; S8442、Sigma-Aldrich) を CMC (0.5% [w/v] カルボキシメチルセルロースナトリウム、0.9% [w/v] 塩化ナトリウム、0.4%) に懸濁しました。 [v/v] ポリソルベート 80、脱イオン水中の 0.9% [v/v] ベンジルアルコール) を、0 日目、7 日目、および 14 日目にマウス (C57BL/6J) に皮下注射しました。マウスは低酸素室に収容されました ( 10% O2) を 7 週間。動物には標準的な食餌を与えた。研究は、実験動物の管理と使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに従って実施されました。

各マウスをヒートボード上で 1.5% イソフルランを使用して麻酔し、心拍数と心電図でモニタリングしました。マイクロチップカテーテル (Millar) を右頸静脈を介して RV に挿入し、RVSP を測定しました。血行力学的測定値は、Lab Chart 8 (ADinstruments) を使用して分析されました。心臓は、RV 肥大 [RV と (左心室 + 中隔) の重量比] の評価および RNA 抽出のために摘出され、肺は形態計測分析および RNA 抽出のために準備されました。

マウスから得たBM細胞を、DMEM、10％FBS、2mM L-グルタミン、100IU/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、100mM非必須アミノ酸、および5ngを含むIL-3含有BMMC完全培地中で培養した。 /ml マウス rIL-3 を使用して BMMCs46 を調製します。 4 ～ 6 週間の培養後、フローサイトメトリーにより、浮遊細胞の >95% が Kit+ FcεRI+ マスト細胞であることが確認されました。 BMMC の脱顆粒は、4-ニトロフェニル N-アセチル-β-グルコサミニドを使用した酵素アッセイで放出された β-HEX の量によって評価されました。

BMMC から馴化培地を得るために、1 × 107 個の BMMC を IL-3 含有 BMMC 完全培地で 2 日間培養しました。中性脂質、リン脂質および遊離脂肪酸は、Sep-Pak C18 カートリッジ (Waters) を使用した固相抽出によって馴化培地から抽出されました。簡単に言うと、馴化培地をSep-Pakカラムに添加し、神経脂質を10mlのヘキサンで溶出した。続いて、遊離脂肪酸を10mlのギ酸メチルで溶出した。リン脂質は最終的に10mlのメタノールで溶出した。遊離脂肪酸画分を実験として使用した。

BMMC (5 × 106 細胞) を、生後 6 週齢の雄 Kit W-sh/Wsh マウスに静脈内注射することによって再構成しました。再構成の 4 週間後、PH を誘発するためにマウスを低酸素状態に置きました。肺における再構成されたBMMCの分布と成熟は、トルイジンブルー染色または蛍光免疫染色によって評価されました。

ケトチフェンフマル酸塩 (Sigma) を H2O に溶解し、低酸素条件下でマウスに 4 週間経口投与しました。ケトチフェン投与群のマウスの飲料水摂取量は、対照群のマウスと変わらなかった。

トルイジンブルー陽性肥満細胞を肺切片全体で計数し、光学顕微鏡下で各マウスの少なくとも20切片を測定した。血管周囲マスト細胞は、分泌顆粒の押し出しに基づいて顆粒化細胞と脱顆粒細胞に分類されました 18。顆粒化マスト細胞は密度の高い細胞質を持っていますが、脱顆粒マスト細胞は分泌顆粒の排出により空のスポットのある軽い細胞質を持っています。肉芽形成指数は、顆粒化マスト細胞数/脱顆粒マスト細胞数の比として計算した。

マウスの肺を採取し、気管を介して 4% パラホルムアルデヒドで 25 cmH2O 圧力で膨張させ、その後 4% パラホルムアルデヒドで固定しました。サンプルをパラフィンに包埋し、厚さ 4 μm で切片にし、ヘマトキシリンエオシン (HE)、エラスティカヴァンギーソン (EVG)、およびトルイジンブルー染色で染色しました。ほぼ循環プロファイルを示す少なくとも 10 本の末梢血管 (<100 μm 直径) が各肺切片からランダムに選択され、次の式を使用して壁厚パーセントを分析しました: [(血管直径 − 血管内腔)/血管直径] × 100。形態計測分析は同時に実行され、研究条件は知らされませんでした。

肺パラフィン切片の免疫組織化学では、沸騰水浴中で回収溶液 (Target retrieval solution S1700、Dako) を使用してパラフィン切片の回収を 20 分間実行しました。切片を室温まで30分間冷却した。洗浄後、切片を一次抗体（マウスサンプルの場合は抗CD31 [E-AB-70021; Elabscience; 1:200]、ヒトサンプルの場合は抗CD31 [ab182981; Abcam; 1:2000]）とともに4℃でインキュベートしました。一晩で℃。一次抗体は、Alexa488 結合ヤギ抗ウサギ IgG (Invitrogen; 1:2000) を使用して視覚化されました。ビメンチンによる対比染色の場合、メーカーの説明に従って、抗ビメンチン (ab8978; Abcam; 1:200) およびアビジン/ビオチンブロッキングキット (Vector Laboratories) およびストレプトアビジンテキサスレッド (Vector Laboratories) を備えた MOM フルオレセイン免疫検出キットを使用して免疫染色を実行しました。プロトコル。トリプターゼおよびPAF-AH2で対比染色した場合、抗トリプターゼ（NPB2-26444; Novus; 1:100）およびアビジン/ビオチンブロッキングキットおよびストレプトアビジンAMCAを備えたMOMフルオレセイン免疫検出キット（Vector Laboratories）を使用して免疫染色を実施しました。抗 PAF-AH2 TI10 モノクローナル抗体 36 (1:100) を HiLyte Fluor 555 Labeling kit (Dojindo Molecular Technologies) によって標識しました。切片は、DAPI を使用した Fluoromount-G (Invitrogen) または Fluoromount (Diagnostic BioSystems) でマウントされました。画像は蛍光顕微鏡 (BZ-9000; Keyence) で取得しました。

「補足図」では、一次抗体（抗ポドプラニン; AF3244; R&D Systems; 1:40、抗 Mac3; 550292; BD Biosciences; 1:100、および抗ビメンチン; ab92547; Abcam; 1:200)、Alexa 546 結合ロバ抗ヤギ IgG、Alexa546 結合ヤギ抗ラット IgG、または Alexa 594 結合ヤギ抗ウサギ IgG (Invitrogen; 1:2000) をそれぞれ使用して視覚化しました。 PAF-AH2での対比染色については、抗PAF-AH2 TI10モノクローナル抗体(1:100)およびアビジン/ビオチンブロッキングキットおよびフルオレセインアビジンDCSを備えたMOMフルオレセイン免疫検出キット(Vector Laboratories)を使用して免疫染色を実施した。ヒト肺パラフィン切片の免疫染色では、一次抗体 (抗ポドプラニン; AF3670; R&D Systems; 1:100、抗 CD68; #76437; Cell Signaling Technology; 1:200、および抗ビメンチン; ab92547; アブカム; 1 :200) を使用し、Alexa594 結合ロバ抗ヒツジ IgG または Alexa594 結合ヤギ抗ウサギ IgG (Invitrogen; 1:2000) によってそれぞれ視覚化しました。 PAF-AH2による対比染色には、抗PAF-AH2 TI10抗体(1:100)およびAlexa 488結合ヤギ抗マウスIgG(1:2000)を使用した。

35 mm ガラスベースディッシュ (Ikki) に播種した初代肺線維芽細胞を 4% パラホルムアルデヒドで固定し、0.2% Triton X-100 で 10 分間透過処理し、その後 1% 血清で 1 時間ブロックしました。細胞を一次抗体で 4 °C で一晩染色しました。 Alexa488結合ヤギ抗ウサギ/マウスIgG(Invitrogen; 1:2000)をDAPIで共染色し、室温で1時間インキュベートした。本研究で使用した一次抗体は、抗 SM22α (ab14106; アブカム; 1:100) および抗 PCNA (ab29; アブカム; 1:100) でした。画像は蛍光顕微鏡 (BZ-9000; Keyence) で取得しました。

肺を灌流し、コラゲナーゼ II (Worthington Biochemical Crop) で消化しました。解離した細胞を 1 時間インキュベートしました。残りの細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ（Ｗａｋｏ）に再懸濁し、Ｐｒｉｍａｒｉａ培養皿（ＢＤ）上に置いた。 24時間後、培地を交換した。さらに３日後、５日後、線維芽細胞培養物を継代し、実験に使用した。

肺線維芽細胞と平滑筋細胞を96ウェルプレートに播種しました。 12 時間後、ω-3 エポキシドまたは脂質抽出物をプレートに添加し、RealTime-Glo MT Cell Viability Assay (Promega) を使用して、マイクロプレートリーダー (Gen5 Synergy HTX; BioTek Instruments) で 48 時間細胞増殖を観察しました。）。

細胞遊走は、24 ウェル、孔径 8 μm 膜浸潤チャンバー (ThermoFisher) を備えたボイデンチャンバーアッセイを使用して実行されました。 2 × 104 個の細胞をトランスウェルの上部チャンバーに播種しました。オメガ-3 エポキシドまたはオメガ-3 脂肪酸を下部チャンバーに添加しました。 24 時間後、移動した細胞を含む膜をメタノールで固定し、トルイジンブルーで染色しました。画像は顕微鏡 (BZ-9000; Keyence) で取得し、遊走細胞数を 10 倍のランダムフィールドで定量化しました。

ヒト肺内皮細胞 (Gibco) を、EGM-2 BulletKit 培地 (CC-3162; Lonza) を使用して、5% CO2 下、37 °C で培養しました。ヒト肺動脈平滑筋細胞（クラボウ）も同様に２０％ウシ胎児血清培地を含むＤＭＥＭ（ワコー）を用いて培養した。細胞は継代 4 ～ 8 の間で使用されました。

活性酸素種の細胞間レベルの測定は、Cellular ROS Assay Kit (abcam) を使用して実行されました。ヒト肺動脈内皮細胞を96ウェルプレートに播種した。 12時間後、H2O2(500μMまたは1mM)刺激ありまたはなしで、ω-3エポキシドまたはω-3脂肪酸をプレートに添加した。 1 時間後、2',7' -ジクロロフルオレシンジアセテートをプレートに添加し、マイクロプレートリーダー (Gen5 Synergy HTX; BioTek) で 485 nm/535 nm で励起/発光を行う蛍光分光法によって 2',7' - ジクロロフルオレシンを測定しました。楽器）。

肺動脈内皮細胞を96ウェルプレートに播種した。 12時間後、H2O2(500μMまたは1mM)刺激ありまたはなしで、ω-3エポキシドまたはω-3脂肪酸をプレートに添加した。 2時間後、マイクロプレートリーダー(Gen5 Synergy HTX; BioTek Instruments)上のCellTiter-Glo発光細胞生存アッセイ(Promega)を使用して、生存細胞の数を測定した。

我々は、ヒト脳 cDNA ライブラリー (Life Technologies, Inc.) からクローン化された全長ヒト Pafah2 cDNA (NCBI 参照配列: NM_000437.4) を保持する pcDNA3.1(+) プラスミドベクター (V790202、Invitrogen) を使用しました 47。 Quik Change Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent) を取扱説明書に従って使用し、ネイティブ Pafah2 cDNA を保持するプラスミドに一塩基置換を導入し、変異体 R85C (253C>T)、Q184R (551A>G)、および S236C を生成しました。 (707C>G)、DNA 配列決定により変異の存在を確認しました。天然または変異体Ｐａｆａｈ２ｐｃＤＮＡプラスミド（６ウェルディッシュ当たり３．５μｇ）を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。 48時間後、培地を交換し、MG132(10μM)を含むまたは含まないDMEMに6時間曝露した。その後、細胞を回収し、ウェスタンブロッティングによりPAF-AH2タンパク質の発現量を解析した。空のpcDNAベクターによってトランスフェクトされたHEK293細胞を対照として使用した。

マウス肺、初代培養線維芽細胞、または HEK293 細胞から単離された等量の総タンパク質を、50 mM Tris-HCl (pH 7.6)、150 mM NaCl、1% Nonidet-P40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、および 0.1% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、および 1 mM ジチオスレイトール (DTT)、100 nM MG132、プロテアーゼ阻害剤カクテル、およびホスファターゼ阻害剤カクテル (ナカライテスク) を補充しました。ウェスタンブロット分析では、ライセートからの等量の総タンパク質 (10 ～ 15 μg) を SDS ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供しました。本研究で使用した一次抗体は、抗PAF-AH2 (TI10; 1:1000)、抗β-アクチン(sc-47778; Santa Cruz Biotechnology; 1:1000)、抗p-Smad 2 S465/467でした。 (#3108)、および抗 Smad 2 (#5339) (Cell Signaling Technology; 1:1000)。タンパク質バンドは、西洋わさびペルオキシダーゼ結合二次抗体（1:2000）および増強された化学発光（Chemi-Lumi One Super; Nacalai Tesque）を LAS-4000 mini（GE healthcare）で使用して視覚化しました。タンパク質バンドはImageJ ver1.52を使用して定量化しました。

定量的リアルタイム PCR では、Trizol 試薬 (Invitrogen) を使用して、肺、RV、または肺線維芽細胞からの全 RNA サンプルを調製しました。総 RNA のサンプル (0.2 ～ 0.5 μg) を、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) を使用して逆転写しました。定量的な mRNA 発現は、THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyobo) を使用したリアルタイム PCR によって評価されました。サンプルは ViiA7 (Applied Biosystems) で実行され、データはデルタデルタ CT 法によって分析されました。 18S リボソーム RNA を増幅し、内部対照として使用しました。遺伝子のプライマー配列は補足表S3にリストされています。

この研究は慶応義塾大学病院治験審査委員会（IRB）の承認を受けており（治験審査委員会番号：20140203）、すべての遺伝子検査は遺伝カウンセリング後、患者様からのインフォームドコンセントを得て実施されました。特発性 PAH 90 名、遺伝性 PAH 61 名、結合組織病関連 PAH 54 名を含む 262 名の患者からの血液サンプルを対象にして分析しました（平均年齢、45.5 ± 16.6 歳、女性、78.0%、平均肺動脈圧、42.9 ± 15.5 mmHg）。。 HiSeq 2500 プラットフォーム (Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ) とハイブリダイゼーションキャプチャ用の SureSelectXT Human All Exon Kit (Agilent Technologies、カリフォルニア州サンタクララ) を使用して、全エクソームシーケンスを実行しました。変異体の病原性は CADD、SIFT、PolyPhen-248,49 で評価されました。 PH患者の全エクソームシーケンスデータにおけるPafah2遺伝子の変異については、CADDスコアが30（MIS30）以上のミスセンス変異を選択した。既知の肺動脈性肺高血圧症 (PAH) 関連遺伝子には、骨形成タンパク質受容体 2 型遺伝子 (BMPR2)、アクチビン A 受容体様 1 遺伝子 (ACVRL1)、エンドグリン遺伝子 (ENG)、カベオリン 1 遺伝子 (CAV-1)、T -ボックス 4 遺伝子 (TBX4)、カリウムチャネルサブファミリー K メンバー 3 遺伝子 (KCNK3)、真核生物開始翻訳因子 2a キナーゼ 4 (EIF2AK4)、SMAD、アデノシン三リン酸 13A3 (ATP13A3)、アクアポリン 1 遺伝子 (AQP1)、成長分化因子2 遺伝子 (GDF2)、および SRY 関連高移動度グループボックスファミリーメンバー 17 遺伝子 (SOX17) は、以前の報告に従って選択されました 48。

PAF-AH2 の初期 3D 構造モデルは、SWISS-MODEL50 を使用した相同性モデリングを使用して取得されました。血漿型 PAF-AH (PDB 番号: 5i9i.1.A) の結晶構造を鋳型として使用しました (配列同一性 42.33%、GMQE スコア 0.74)。分子動力学シミュレーションは、Nanoscale Molecular Dynamics (NAMD) バージョン 2.1252 と Chemistry at Harvard Molecular Mechanics (CHARMM) 36 力場 53 を使用して、水溶性条件で実行されました。各原子と水分子の位置と速度ベクトルは 2.0 フェムト秒 (1 × 10−15 秒) ごとに計算され、直接相互作用のカットオフ長が 12 Å である Particle Mesh Ewald (PME) の総和が使用されました。長距離静電相互作用を予測する54。シミュレーションは、rigibBonds all のオプションを使用して実行され、システムは生理学的条件 (150 mEq/l) で NaCl で中和されました。水分子は、移動可能な分子間ポテンシャル水分子 (TIP3P) としてモデル化されました。各変異体の初期構造は、Visual Molecular Dynamics (VMD) バージョン 1.9.352 の変異残基プラグインを使用して、水溶性条件で野生型の初期構造に対してアミノ酸置換を誘導することによって得られました。野生型とともに各変異体の安定構造は、72 ナノ秒間のシミュレーションを実行することによって計算されました。二乗平均平方根偏差 (RMSD) を使用して、計算が安定していることを確認しました (補足図 11a-c)。 RMSD は、初期モデルとの相対的な距離を使用して計算されました。野生型の初期モデルは水に溶媒和された相同性モデリングの即時出力でしたが、変異体の初期モデルは野生型の安定した構造でした (60 ナノ秒のシミュレーション後)。すべての結果は、VMD バージョン 1.9.3 を使用して視覚化されました。シミュレーションは、周期境界条件を使用して境界サイズ 7.37 nm × 8.34 nm × 8.22 nm で実行されました。原子数は、WT、R85C、Q184R モデルでそれぞれ 46628、46615、46635 個でした（水とイオンを含む）。モデルが安定した後の構造変動を表す時間窓であるフレーム2700～3000（54～60ナノ秒に相当）から取得した300フレームの積層スナップショットを図として示した。

データは平均値 ± SEM として表示されます。リピドミクスデータの Z スコアは Microsoft Excel 2019 を使用して計算され、ヒートマップとして表示されました。 2 つのグループ間の差異の統計的有意性は、対応のない Student の T 検定を使用して決定されました。複数のグループ間の差異は、一元配置または二元配置分散分析とそれに続く事後検定を使用して比較されました。統計分析は、GraphPad Prism バージョン 9 を使用して実行されました。P < 0.05 の値は、統計的に有意であると考えられました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究の結果を裏付けるデータは、論文およびその補足情報内で入手できます。リピドミクスデータは、アクセッション番号 ST001951 (https://doi.org/10.21228/M8PH6J) で Metabolomics Workbench に寄託されています。この研究で使用した血漿型 PAF-AH の結晶構造は、Protein Data Bank で PDB 番号: 5I9I (https://www.rcsb.org/structural/5I9I) で入手できます。全エクソーム配列決定データは、研究参加者のプライバシーを侵害する可能性のある情報が存在するため、一般には公開されていません。仮名化された個人レベルのデータを入手するには、研究者はデータアクセス委員会（MK）の主要メンバー（[email protected]）に連絡し、科学的に適切な要求を行う必要があります。全体として、これらのデータは研究目的でのみ使用でき、商用利用はできません。すべての申請書には、科学的目的、目的、方法、スケジュール、データ管理、倫理的配慮、財務上の問題、競合する利益について詳細に記載する必要があり、また、プロジェクト計画と、研究責任者および主任研究者に関する情報も含める必要があります。すべてのリクエストは慶応義塾大学の治験審査委員会によって審査され、リクエストを行った研究者は慶応義塾大学とのデータアクセス契約に署名する必要があります。データのリクエストは、書面による倫理的承認が著者に提出された場合、1 か月以内に処理されます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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優れた技術支援をしていただいた三宅佳子氏（慶応義塾大学）と琴田誠一氏（バイオリサーチセンター会社、日本）に感謝いたします。この研究は、助成番号 JP22gm5910014 (JE) および JP22gm1210013 (NK) の日本医療研究開発機構 (AMED)、公益財団法人泉心医学研究財団 (JE)、日本臨床薬理学研究財団 (JE)、および慶応義塾大学助成金の支援を受けました。 -若手医学者（HM）の奨励のための援助。

慶応義塾大学医学部循環器内科

Hidenori Moriyama, Jin Endo, Masaharu Kataoka, Shinichi Goto, Hiroki Kitakata, Takahiro Hiraide, Naohiro Yoshida, Sarasa Isobe, Tsunehisa Yamamoto, Kohsuke Shirakawa, Atsushi Anzai, Yoshinori Katsumata, Keiichi Fukuda & Motoaki Sano

東京大学大学院薬学系研究科健康化学教室

Yuta Shimanaka, Nozomu Kono & Hiroyuki Arai

慶応義塾大学医学部生化学教室

Yuki Sugiura & Makoto Suematsu

慶応義塾大学医学部遺伝医療センター

小崎健次郎

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HM と JE は実験を設計して実行し、データを分析して原稿を書きました。 MK と TH は患者のサンプルを収集し、データを分析しました。 Y.Shimanaka、Y.Sugura、および NK は包括的なリピドミクス解析を実行しました。 SG は分子動力学シミュレーションを実行しました。 HK、NY、SI、TY、KS、AA、YK が実験を実施し、データを分析しました。 KK は全エクソソームシーケンスを実行しました。末松正、KF、HA、佐野正が実験を計画し、結果を解釈した。

遠藤仁氏への対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Mark Nicolls、Wen Tian、Karsten Weylandt、およびその他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

森山洋、遠藤淳、片岡正他マスト細胞内のPAF-AH2によって産生されるオメガ-3脂肪酸エポキシドは、肺血管リモデリングを調節します。 Nat Commun 13、3013 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-30621-z

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受信日: 2021 年 3 月 3 日

受理日: 2022 年 5 月 3 日

発行日: 2022 年 5 月 31 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30621-z

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