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Aug 06, 2023

PEG2000

Rapporti scientifici Volume 12,

Scientific Reports volume 12、記事番号: 10564 (2022) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

分子イメージングおよびセラノスティックスにおけるリポソームの有用性に対する我々の関心を考慮して、我々は、リポソームの外層のコーティングが、in vitro および in vivo の乳癌組織における乳がん細胞株による内部移行にどのような影響を与えるかを調査しました。 実際、DBCO (ジベンゾシクロオクチン) ソフトコーティングによって、著しく高いリポソーム取り込みが達成できることを発見しました。 我々のデータは、末端脂質をDBCO部分で特定の密度で修飾すると、従来の修飾されていないリポソーム（腫瘍取り込み～20％）と比較して、in vivoでの腫瘍取り込みの増加（腫瘍取り込み～50％）を誘導することを示しています。 この研究では、4T1 同所性乳がんモデルと原発乳腫瘍異種移植片モデル MDA-MB-231 および MDA-MB-436 を使用して、生体内での乳がん細胞の視覚化が向上したことを報告します。 L-PEG2000-DBCO でコーティングされたリポソームは、腫瘍の大きさ、種類、位置、受容体発現、宿主マウスの状態とは無関係に、乳がん細胞における蓄積の増加を示します。 私たちは、これらの発見が、画像誘導アプリケーションや精密医療治療におけるリポソームの実用性に大きなプラスの影響を与えると期待しています。

リポソームは、水性コアをカプセル化する脂質二重層からなる脂質小胞であり、最も有望で効果的な薬物送達ビヒクルの 1 つと考えられています 1,2。 リポソームは、その臨床的可能性を最適化するために、過去 30 年にわたって広範囲に研究されてきました。 薬物送達におけるリポソームの応用で最も成功しているのは、卵巣がんや多発性骨髄腫をはじめとする疾患での臨床使用が承認された 2 種類のリポソームドキソルビシン製剤 (Doxil、Myocet) です。 しかし、これらの治療上の成功にもかかわらず、分子イメージングおよび画像誘導療法におけるリポソームの臨床開発は大幅に遅れています。 これまでのところ、克服すべき主な制限は、腫瘍組織によるリポソームの取り込みが比較的低いことです。 これらの驚くべきナノキャリアの臨床応用を促進するために、腫瘍への高い取り込みを促進できる新しいリポソーム製剤に対する満たされていないニーズがあります。

表面修飾により、診断、治療、画像誘導送達用途向けのリポソームのカスタム設計が可能になります6、7、8、9、10、11。 リポソームのユニークな利点には、最小限の免疫反応性、タンパク質分解の減少、循環時間の増加、費用対効果の高い方法での再現可能な組み立てが含まれます。 その結果、リポソームは、人間の病気の診断、監視、管理のための魔法のようなナノキャリア ツールとなります 12,13。

分子イメージング療法用のリポソームの臨床開発に関心があるため、特定の表面密度でリポソームの外層をコーティングすることが、in vitro および in vivo での細胞内在化にどのように影響するかを調査しました。 実際、我々は、DBCO (ジベンゾシクロオクチン) ソフトコーティングによって、腫瘍組織による著しく高いリポソームの取り込みが in vitro および in vivo で達成できることを発見しました。 我々のデータは、末端脂質をDBCO部分で特定の密度で修飾すると、従来の修飾されていないリポソーム（腫瘍取り込み～20％）と比較して、in vivoでの大幅な腫瘍取り込み（～50％）が生じることを示しています。 動物モデルでは、4T1 同所性乳がん細胞および原発性乳がん細胞株 MDA-MB-231 および MDA-MB-436 からの異種移植片による取り込みの増加を視覚化することができました。 我々の発見は、リポソーム表面と細胞膜の間の相互作用が細胞への取り込みに大きな影響を与えるという最近の発見と一致しています。 リポソーム表面が細胞内在化経路をどのように調節するのかをより深く理解することで、細胞内薬物送達を改善する機会が得られます14。

私たちの発見は、効率的な腫瘍の取り込みを促進する修飾された表面特性を備えた次世代のリポソームの開発への道を切り開き、ひいては精密医療治療における臨床使用の計り知れない可能性を実証します。 当社は、これらの強化されたリポソームの利点を、高精度の画像誘導手術、陽電子放出断層撮影法 (PET) 放射線追跡装置による腫瘍の高精度検出、および原発腫瘍とその遠隔転移への放射線治療ペイロードの正確な送達による腫瘍治療に活用できると期待しています。 これらの野心的な研究は私たちの研究室で進行中であり、やがて出版される予定です。

リポソームは、次の手順に従って図 1a に示すように組み立てられました。骨格脂質 (DOPC)、機能性脂質 (DSPE-PEG2000-DBCO、または DSPE-PEG2000)、およびイメージング材料 (DiI、または DiR) がクロロホルムに溶解され、薄膜を形成した後、再水和、押出、透析を行います。 サイズとゼータ電位はそれぞれ〜95 nmと-4.8 mVでした（表S1）。 L-PEG2000-DBCOの表面形態は、図1bに示すように走査型電子顕微鏡（SEM）を使用して画像化されました。 L-PEG2000-DBCO (L-DBCO) の直径は約 96 nm、隣接する DBCO 端子間の距離は 25 Å でした (図 1b および表 S1)。

望ましい DBCO 密度を備えた L-PEG2000-DBCO アセンブリ: (a) リポソームアセンブリ手順のスキーム、および (b) L-PEG2000-DBCO 表面形態は走査型電子顕微鏡 (SEM) を使用して画像化され、DBCO コーティング アレイはカートン スキームで表示されます。 L-PEG2000-DBCO 表面形態の潜在的な構造を示します。

我々は、インビトロでのフローサイトメトリーと共焦点顕微鏡検査を利用して、L-PEG2000-DBCOが従来のL-PEG2000よりも優れていることを実証しました。 予想通り、図2aに示すように、フローサイトメトリーでは、非腫瘍細胞株（Vero）におけるL-PEG2000（DiIで標識）とL-PEG2000-DBCO（DiIで標識）の間で細胞取り込みの有意差は観察されませんでした。 対照的に、L-PEG2000-DBCOは、図2b〜dに示すように、乳がん細胞（MCF-7、MDA-MB-231、およびMDA-MB-436）においてより高い細胞取り込みを示しました。 異なる細胞に対する DiI、L-PEG2000、および L-PEG2000-DBCO ピークの平均値を表 S1 (補足資料) に示しました。 L-PEG2000-DBCO 染色のシグナル強度は、L-PEG2000 と比較して、MCF-7、MDA-MB-231、および MDA-MB-436 でそれぞれ 258%、303%、255% 増加しました。 総合すると、これらのデータは、両方のリポソーム製剤 (DiI で標識) が正常細胞と乳がん細胞を区別し、L-PEG2000-DBCO が L-PEG2000 と比較して乳がん細胞への蓄積において優れていることを示しています。 さらに、私たちの発見をさらに確認するために共焦点顕微鏡を使用しました。 図２ｅに示すように、Ｌ−ＰＥＧ２０００−ＤＢＣＯの染色強度は、Ｌ−ＰＥＧ２０００と比較して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞において２４４％増加した。

DiI で標識されたリポソーム製剤を使用したフローサイトメトリーおよび共焦点顕微鏡研究 (偽が培養培地を表すことを除く): (a) 非腫瘍性細胞株 (Vero)、(b) Her2/neu+ 原発腫瘍細胞株 (MCF-7)、( c) トリプルネガティブ乳がん (TNBC) 細胞株 (MDA-MB-231)、(d) 転移能の高いトリプルネガティブ乳がん (TNBC) 細胞株 (MDA-MB-436)、および (e) リポソームの共焦点顕微鏡検査MDA-MB-231 細胞株の製剤。

上記のインビトロデータをさらに確認し、それに基づいて構築するために、生体内での光学イメージングを利用しました。 私たちは、外科的切除後の転移巣または再発巣を模倣するために、小さな同所性腫瘍（15〜25 mm3）におけるL-PEG2000-DBCOおよびL-PEG2000の性能をテストしました16、17。 BALB/c マウスにおける腫瘍の増殖と 4T1 細胞の転移は、ステージ IV のヒト乳がんを模倣していると報告されています 18。 実際、図3a〜cに示すデータは、L-PEG2000リポソームと比較してL-PEG2000-DBCOの腫瘍への取り込みが優れていることを示しています。 L-PEG2000-DBCO は、腫瘍病巣では 54% という著しく高い取り込みを示しますが、肝臓での取り込みは 16% に限定されていました。 対照的に、L-PEG2000は、77％のリポソームが肝臓およびERシステムに捕捉されているため、この小さな腫瘍を検出できませんでした（図3c、d）。 腫瘍組織における 2 つのリポソーム製剤の蓄積率を図 3c、d に示します。 全体として、L-PEG2000-DBCO は、L-PEG2000 よりも 700% 増加した腫瘍蓄積を示しました。

L-PEG2000-DBCO による小さな同種異系乳がん病巣 (腫瘍サイズ 15 ～ 25 mm3 の 4T1) の検出。 (a、b) (a) L-PEG2000 および (b) L-PEG2000-DBCO によって得られた腫瘍取り込みの並べて比較。 （c）120時間にわたる腫瘍におけるL-PEG2000およびL-PEG2000-DBCOの生体内分布の経時変化、および（d）肝臓における120時間にわたるL-PEG2000およびL-PEG2000-DBCOの生体内分布の経時変化。

さらに、96 時間後の 2 回目のリポソーム投与では、血液クリアランスの加速は引き起こされませんでした。 PEG化リポソームを含むPEG結合物質の反復投与は免疫原性反応を引き起こし、PEG結合物質/PEG化ナノキャリアのクリアランスの増加と有効性の低下を引き起こす可能性があることが報告されています19、20、21。

我々は、他の乳がん異種移植片にも研究をさらに拡張し、乳がん異種移植片を検出するL-PEG2000-DBCOの能力をさらに確認した。 図 4 に示すように、MCF-7 (211 mm3)、MDA-MB-231 (507 mm3)、および MDA-MB-436 (232 mm3) に高濃度で蓄積した L-PEG2000-DBCO が腫瘍異種移植片を除去しました。

L-PEG2000-DBCO を使用した乳がん異種移植片の光学イメージング: MCF-7 (211 mm3)、MDA-MB-231 (507 mm3)、および MDA-MB-436 (232 mm3)。

次に、MDA-MB-231 腫瘍異種移植片を有するマウスから肝臓および腫瘍組織を切除し、ex vivo 光学イメージングおよび共焦点顕微鏡検査を実施しました。 この結果は、L-PEG2000 に対する L-PEG2000-DBCO の優位性を裏付ける上記のデータとも一致しました。 図5に示すように、L-PEG2000-DBCOは腫瘍内でL-PEG2000を3倍以上上回り、肝臓での蓄積は40％少なくなりました（図5b、c）。 さらに、共焦点顕微鏡では、L-PEG2000と比較して、L-PEG2000-DBCOの腫瘍取り込みがより高く、取り込みがより低いことも実証されました（図5d）。 まとめると、インビボおよびエクスビボの結果は、腫瘍組織に高濃度で蓄積する際の L-PEG2000-DBCO の高い性能を強く裏付けており、さまざまな分子の強力なナノキャリアとしての L-PEG2000-DBCO の有用性の計り知れない可能性を強調しています。イメージングおよび画像ガイド付きアプリケーション。

MDA-MB-231腫瘍異種移植片の腫瘍組織および肝臓におけるL-PEG2000-DBCOおよびL-PEG2000を用いたex vivo光学イメージングおよび共焦点顕微鏡検査：（a）L-PEG2000とL-PEG2000の等しい蛍光強度を実証する対照実験- DBCO、(b) 腫瘍組織および肝臓における L-PEG2000-DBCO および L-PEG2000 による ex vivo 光学イメージング、(c) 腫瘍組織における L-PEG2000-DBCO および L-PEG2000 の蛍光シグナル強度に基づく定量的取り込み、およびリポソーム投与後 24 時間の肝臓、および (d) 腫瘍組織および肝臓切片における L-PEG2000-DBCO および L-PEG2000 の共焦点顕微鏡イメージング。

私たちの発見を最終化し強化するために、小さな腫瘍を視覚化する際のL-PEG2000-DBCOの顕著な能力を実証するために、生体内でのL-PEG2000-DBCOの有用性を調べました。 実際、L-PEG2000-DBCOは、図6a、bの矢印で示すように、肉眼でも明視野でも見えなかった小さな皮下乳房腫瘍（MDA-MB-231、サイズ10〜20 mm3）を検出できました。 。 小さな腫瘍が脂肪体に移植されているため、傍癌組織から分離するのが困難であることに注意することが重要です。 その結果、図6bの腫瘍サイズは、キャリパーで測定した固形腫瘍の正確なサイズよりも大きく見えます（写真は図S4に示されています）。 また、図6bは、傍癌組織のシグナルが図6bに示されているように、本発明のL-PEG2000-DBCOが癌組織と傍癌組織の両方に対してスーパーターゲティング能力を有することを示している。 さらに、図6bに示すように、L-PEG2000-DBCOは、より大きなサイズの腫瘍異種移植片においてL-PEG2000よりも優れていました。 図6cに示すように、エクスビボ光学イメージングによってもインビボデータが確認されました。

(a) L-PEG2000-DBCO による光学イメージングにより、初期段階の皮下乳房腫瘍 (腫瘍サイズ 10 ～ 20 mm3 の MDA-MB-231、移植後 3 日) の検出が可能になりました。矢印); （b）L-PEG2000-DBCOによる腫瘍および主要臓器のex vivo光学イメージング、および（c）L-PEG2000-DBCOと比較したL-PEG2000によるMDA-MB-231腫瘍異種移植片の光学イメージング。

過去数十年にわたってリポソーム技術に関して多大な研究が行われてきたにもかかわらず、リポソームの表面配合を最適化するアプローチはほとんど研究されていないままです。 我々の発見は、細胞内部移行と腫瘍取り込みにおける表面機能部分の重要な役割を実証しています。 リポソーム表面は、さまざまな治療用途で薬物を結合させる（いわゆる標的リポソーム）ために広く利用されており、銅を含まない「クリックケミストリー」による薬物結合部位として DBCO 部分を使用するものもあります 22,23,24。 しかし、表面結合はリポソームの細胞内在化と腫瘍取り込みの効率を低下させ、薬物送達の有効性を低下させる可能性があります。 この研究では、リポソーム表面を DBCO 部分 (L-PEG2000-DBCO) でコーティングすると、腫瘍への取り込みが著しく高くなる可能性があることを発見しました。 我々は、L-PEG2000-DBCO が従来の L-PEG2000 よりも優れていることを実証するために、一連の in vitro、in vivo、ex vivo 実験を実施しました。 我々はまず、フローサイトメトリーと共焦点顕微鏡により、正常細胞および乳がん細胞におけるリポソームの取り込みを in vitro で研究しました。 フローサイトメトリーでは、L-PEG2000と比較してL-PEG2000-DBCOの取り込みが高いことが示され、この所見は共焦点顕微鏡によってさらに確認されました（図2）。 光学イメージングは​​、リポソーム脂質二重層に封入された蛍光色素を介してインビトロおよびインビボでのリポソーム輸送をモニタリングするために効果的に使用できるため、我々は光学イメージングを利用して、乳がんのさまざまなモデルにおけるインビボでの L-PEG2000-DBCO の生体内分布を追跡しました。 対照実験では、等量のL-PEG2000とL-PEG2000-DBCOを含むリポソーム溶液は同様の蛍光強度を示し（図5aおよび図S2）、インビトロおよびインビボでのリポソームの体内分布を定量化するための尺度として蛍光強度の使用を正当化します。そして生体外。 乳房腫瘍の検査 (図 3、4、5、6) では、L-PEG2000-DBCO は、L-PEG2000 と比較して、in vivo で腫瘍組織に優先的に取り込まれ、肝臓および脾臓での取り込みが減少することが実証されました。 たとえば、MDA-MB-231 腫瘍異種移植片で得られた in vivo データは、L-PEG2000-DBCO および L-PEG2000 の腫瘍シグナル強度が 12.2 × 1010 および 3.9 × 1010 p/sec/sr/mW であることを示しました (図.5c)はそれぞれ、L-PEG2000と比較した場合、L-PEG2000-DBCO腫瘍蓄積の213%増加に相当する。 対照的に、L-PEG2000 および L-PEG2000-DBCO の肝臓シグナル強度はそれぞれ 11.2 × 1010 および 6.3 × 1010 p/sec/sr/mW であり、L-PEG2000-DBCO の肝臓への取り込みが相対的に 46% 減少したことに相当します。 L-PEG2000まで。 さらに、共焦点顕微鏡によって画像化された腫瘍および肝臓の組織切片により、生体内および生体外の光学画像化がさらに確認されました（図5d）。

私たちは、この発見が分子イメージング化合物、画像誘導プローブ、および癌治療薬の効率的な送達に応用されることを期待しています。 利点の 1 つは、L-PEG2000-DBCO が小さな同所性 4T1 インプラントなどの小さな腫瘍を視覚化できることです (図 2)。 L-PEG2000-DBCO は、図 6 の矢印で示すように、肉眼でも明視野でも見えなかった小さな皮下乳房腫瘍 (MDA-MB-231、サイズ 10 ～ 20 mm3) を検出できました。 、図1および2のデータ。 図３および６は、Ｌ－ＰＥＧ２０００－ＤＢＣＯが同種（４Ｔ１）および異種（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）移植モデルの両方において小さな腫瘍を視覚化する能力を示したことを実証する。 さらに、L-PEG2000-DBCO は、小さな腫瘍 (10 ～ 15 mm3) と隣接する主要な MDA-MB-231 腫瘍 (196 ～ 255 mm3) を検出、視覚化、識別することができ、小さな腫瘍に蓄積することができました。信号密度は大きな腫瘍の信号密度と同じです (図 S3)。 そこで私たちは現在、分子イメージングや画像誘導手術におけるL-PEG2000-DBCOの有用性を追求しています。

L-PEG2000-DBCO の腫瘍への高い取り込みを引き起こすメカニズム、および DBCO 部分によってこれがどのように促進されるかは完全には理解されていません。 例えば、L-PEG2000-DBCO と DV1-N3 ペプチドの結合は、L-PEG2000 と同様に腫瘍取り込みの減少につながり、高い腫瘍取り込みの推進における DBCO 部分の重要な役割を強調しています 12。 透過性および保持（EPR）の強化効果が腫瘍への取り込みの強化に寄与している可能性があります。 循環時間が長いため、リポソームは透過性の腫瘍血管系を通って腫瘍組織に優先的に浸透し、リンパ排液障害を通じて腫瘍床に留まることができます25。 しかし、EPR 効果だけでは、ナノドラッグデリバリーの増加は 2 倍未満であると報告されています 25,26。 腫瘍組織における L-PEG2000-DBCO の高蓄積と、通常は治療毒性を媒介する非標的組織における低蓄積のメカニズムを解明するには、DBCO 標識リポソームのさらなる研究が必要となります。 DBCO 標識リポソームの化学修飾を強化すると、腫瘍特異性が向上した製剤が強化される可能性があります。 これらの研究は私たちの研究室で進行中であり、将来の出版物で報告される予定です。

要約すると、リポソーム表面は、オフターゲット組織への浸透を最小限に抑えながら、in vitro での細胞取り込みと in vivo での腫瘍組織への浸透に大きな影響を与える可能性があります。 私たちは、私たちの発見が、分子イメージングや画像誘導プローブ、さらには抗がん治療薬の効率的な送達のための次世代リポソームの設計への道を開くだろうと楽観的に考えています。

我々は一連の in vitro および in vivo 実験を実施し、リポソーム表面修飾が in vitro での高度な細胞内在化および in vivo での癌組織における高度なリポソーム蓄積の誘導に重要な役割を果たしている可能性があることを実証しました。 具体的には、両方のリポソーム製剤が同一の骨格を共有しているにもかかわらず、DBCO の柔らかい層が L-PEG2000 と比較して L-PEG2000-DBCO の腫瘍取り込みの顕著な増加を誘導することを発見しました。 我々は、腫瘍の大きさ、種類、位置、受容体発現、宿主マウスの状態とは無関係に、L-PEG2000-DBCO が乳癌病巣に蓄積する能力が増加していることを実証しました。 注目すべきことに、L-PEG2000と比較して、肝臓および標的外組織におけるL-PEG2000-DBCO取り込みの有意な減少も観察された。 まとめると、我々の発見は、腫瘍組織による内部移行を強化した新しいリポソーム製剤の開発への道を開くことになるでしょう。 私たちは現在、分子イメージングおよび画像誘導プローブの効果的なキャリアとしての L-PEG2000-DBCO の有用性を研究しています。

1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[ジベンゾシクロオクチル(ポリエチレングリコール)-2000] (アンモニウム塩) (DSPE-PEG2000-DBCO)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-2000] (アンモニウム塩) (DSPE-PEG2000) および 1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DOPC) は、Avanti Polar Lipids (アラバマ州アラバスター) から購入しました。 1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩 (DiI) は、Sigma-Aldrich (セントルイス、ミズーリ州) から購入しました。 Cy5 アミン (非スルホン化) は、APExBIO Technology LLC (テキサス州ヒューストン) から購入しました。 (1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドトリカルボシアニンヨージド) (DiR) は、Biotium™ (Fremont, CA) から購入しました。 認定ウシ胎児血清 (FBS) は、Life Technologies Corporation (ニューヨーク州グランド アイランド) の Gibco® から入手しました。 Nuclepore トラックエッチング膜 (細孔サイズ: 100 nm、200 nm) は Whatman (Florham Park、NJ) から入手しました。

PEG2000-DBCO で修飾されたリポソーム (L-PEG2000-DBCO) および PEG2000 でコーティングされたリポソーム (L-PEG) はエクストルージョン法によって調製されました 15。 簡単に言うと、DOPC: DSPE-PEG2000-DBCO: DiR 色素 (97:2:1、モル:モル:モル) または DOPC: DSPE-PEG2000: DiR 色素 (97:2:1、モル:モル:モル) の混合物です。クロロホルムに可溶化し、減圧下でロータリーエバポレーターで乾燥させた。 特に、望ましい実験計画に従って、DiR 色素を DiI および Cy5-アミンに切り替えることができます。 脂質フィルムを５ｍＬのＤＩ水（ｐＨ７．０）中で穏やかに振盪しながら水和させて、２．６ｍＭの脂質溶液を得た。 脂質溶液は 10 サイクルの凍結融解を経て、多層リポソームを形成しました。 リポソームは、200 nm および 100 nm のポリカーボネート ナノ多孔質膜を使用して、Northern Lipids Extruder を介して連続的に押出されました。 押出後、Slide-A-Lyzer 透析カセット (MWCO 100 kDa) を使用して、リポソーム溶液を Tris-HCl 緩衝液 (pH 7.4) 中で室温 (RT) で一晩透析しました。

動的光散乱 (DLS) を使用して、カップリング反応中およびカップリング反応後の小胞の完全性、サイズ、ゼータ電位をモニタリングしました。

リポソーム (1 mL、2.6 μM 脂質) を、氷浴中で 1 分間、0.1 M PBS 中の 1% OsO4 で染色しました。 溶液を100nmの核細孔トラックエッチング膜を通して濾過した。 フィルムを段階的にエタノール (50% – 75% – 100% – 100%) で各ステップで 15 分間脱水しました。 製造業者の指示に従って臨界点乾燥によりフィルムを乾燥させた。 フィルムは導電性テープでスチールディスクの上部に貼り付けられ、金でスパッタリングされ、SEM 検出に使用されました。

すべての細胞株は、American Type Culture Collection (ATCC、バージニア州マナッサス) から入手しました。 Cercopithecus aethiops 由来の非腫瘍性腎上皮細胞 - 腎臓正常細胞株 (Vero)、ヒト Her2/neu+ 原発性乳がん細胞株 (MCF-7)、ヒトトリプルネガティブ乳がん細胞株 (MDA-MB-NT17631 および MDA- MB-436) およびマウス乳上皮癌細胞株 (4T1) が現在の研究で使用されました。 すべてのがん細胞株は、10% FBS および 100 単位のペニシリン - ストレプトマイシンを含む DMEM で培養されました。 すべての細胞は、5% CO2 の加湿インキュベーター内で 37 °C に維持されました。

フローサイトメトリーでリポソーム結合を分析するために、Vero、MCF-7、MDA-MB-231、および MDA-MB-436 (2 × 106) を 75 cm2 フラスコに 2 ～ 5 日間播種しました。 ５０％コンフルエンスに達した後、０．２５％トリプシン／０．１％ＥＤＴＡによって細胞を剥離し、続いてＰＢＳで２回洗浄した。 BSA (1%) で 30 分間ブロッキングした後、5% CO2 の加湿インキュベーター内で 37 °C で 2 時間、サンプルを DiI 色素を含むリポソームで染色しました (細胞 106 個あたり脂質 0.15 mM)。 ＰＢＳで２回洗浄した後、サンプルを５００μＬのＰＢＳに再懸濁し、ＢＤ ＬＳＲ ＩＩアナライザー（Ｂ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＣＡ）を使用するフローサイトメトリーによって評価した。

細胞へのリポソームの取り込みを共焦点顕微鏡で分析しました。 MDA-MB-231 細胞 (2 × 105) を、2 mL 培地とともに Lab-Tek II チャンバー スライド システムに個別に播種し、37 °C で一晩培養しました。 サンプルを、5% CO2 の加湿インキュベーター内で 37 °C で 2 時間、DiI 色素を含むリポソームで染色しました (106 細胞あたり脂質 0.15 mM)。 培地を除去した後、細胞をＰＢＳで２回リンスし、ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒドを用いて室温で１０分間固定した。 DAPI を使用して細胞核を染色し、その後 PBS で 3 回洗浄しました。 細胞をLSM 710共焦点蛍光顕微鏡(Zeiss)で検査した。 デジタル画像をキャプチャし、ソフトウェア Image J (NIH) で処理しました。

すべての動物実験は、ストーニーブルック大学施設内動物管理使用委員会 (IACUC) によって評価および承認されています。 すべての動物実験は、承認された IACUC プロトコールのガイドラインおよび ARRIVE ガイドラインに従って実施されました。

24 匹の雌 NOD.Cg-Prkdcscid/J マウス (SCID マウス) と 12 匹の雌 Babl/C マウスを Jackson Laboratory (メイン州バーハーバー) に注文しました。 同種移植モデルでは、4T1 細胞を 3 枚のプレートから採取し、PBS で洗浄しました。 次いで、マウスあたり２０ｋ細胞の細胞懸濁液を、小さな切開を用いて２番目（下から数えて）の乳房脂肪部分に注射して、注射部位に単一の腫瘍結節を確立した。 3日間の増殖後、4T1細胞は乳房脂肪体に移植され、15〜25mm3の固形腫瘍を形成した。 次いで、マウスを２つのグループ、すなわちＬ－ＰＥＧ２０００グループおよびＬ－ＰＥＧ２０００－ＤＢＣＯグループに分け、それぞれＩＶ注射によってリポソーム製剤を投与した。 リポソーム投与後、マウスの腫瘍シグナル強度、体重、および生活状態を設計された時点で記録しました。 ２回目の注射サイクルは、最初のリポソーム投与の９６時間後に投与された。

異種移植モデルの場合、MCF-7、MDA-MB-231、および MDA-MB-436 細胞を 12 枚のプレートから採取し、PBS で洗浄しました。 次に、マウスあたり50,000個の細胞懸濁液を右肩に皮下注射して、異種乳がんモデルを構築しました。 MDA-MB-231 では 7 ～ 10 日後、MDA-MB-36 では 15 ～ 20 日後、MCF-7 では 25 ～ 30 日後に、腫瘍サイズは約 100 mm3 に達しました。 次に、異なるグループの乳がんモデルに同量の L-PEG2000 または L-PEG2000-DBCO を注射しました。

インビボおよびエクスビボイメージングは​​、IVIS Lumina III システム (Perkin Elmer) を使用して実行されました。 簡単に説明すると、蛍光強度が同じレベルであることを確認するために、投与前に 3 × 100 μL の L-PEG2000 および L-PEG2000-DBCO 溶液を 96 ウェル プレートに別々に置き、以下のパラメーターを使用して DiR 近赤外照射下でスキャンしました。励起フィルター 740 nm、発光フィルター 790 nm、ビニング 4 または 8、f/Stop 2。さまざまなリポソームを投与したこれらのマウスを、麻酔下 (IVIS 機器の気化器を介した 2% イソフルラン) で非侵襲的に 3 回スキャンしました。 インビボ分析後、マウスを直ちに屠殺した。 臓器 (腫瘍、肝臓、心臓、肺、脾臓、脳、腎臓、小腸、結腸) が収集され、上記と同じパラメーターを使用して画像が取得されました。 収集された画像は、Living Image 4.3.1 ソフトウェア (Perkin Elmer) を使用して分析されました。各臓器を適切に選択するために ROI が設計され、放射効率が計算されました。

腫瘍を有するマウスに、2% DiI 成分を含む L-PEG2000 および L-PEG2000-DBCO リポソームをそれぞれ注射しました。 リポソーム投与の 24 時間後、腫瘍と肝臓を採取し、-80 °C の冷蔵庫で凍結します。 凍結サンプルをクライオスタット (CM3050 S、Leica、ドイツ) を使用してさらに切片 (10 μm) に切断しました。 切片を DAPI で染色し、封入オイルで封止し、共焦点レーザー走査顕微鏡 (Zeiss、LSM 710) を使用して観察しました。

すべての定量的実験は 3 回実行し、特に指示がない限り、結果は平均 ± 標準偏差として表されました。 データの統計分析は、Tukey の事後検定を使用した二元配置分散分析 (ANOVA) によって実行されました。 p < 0.05 のレベルのグループ間の差異は統計的に有意 (* で示される) とみなされ、p < 0.01 のグループ間の差異は非常に有意である (** で示される) と見なされます。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 [およびその補足情報ファイル] に含まれています。

Lamichhane、N. et al. リポソーム：臨床応用と画像誘導薬物送達の可能性。 分子 https://doi.org/10.3390/molecules23020288 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

リー、M.ら。 リポソームの組成設計と医療応用ユーロ。 J.Med. 化学。 164、640–653。 https://doi.org/10.1016/j.ejmech.2019.01.007 (2019)。

論文 ADS CAS PubMed Google Scholar

Cattel, L.、Ceruti, M. & Dosio, F. 従来のリポソームからステルス リポソームへ: がん化学療法の新境地。 腫瘍 89(3)、237–249 (2003)。

記事 CAS Google Scholar

Soloman, R. & Gabizon, AA リポソーム アントラサイクリンの臨床薬理学: ペグ化リポソーム ドキソルビシンに焦点を当てる。 クリン。 リンパ腫骨髄腫。 8(1)、21-32。 https://doi.org/10.3816/clm.2008.n.001 (2008)。

論文 PubMed Google Scholar

エイブラハム、SA et al. ドキソルビシンのリポソーム製剤。 方法酵素mol。 391、71–97。 https://doi.org/10.1016/s0076-6879(05)91004-5 (2005)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Malam, Y.、Loizidou, M. & Seifalian, AM リポソームとナノ粒子: がんにおける薬物送達のためのナノサイズのビヒクル。 トレンドファーマコル。 科学。 30(11)、592–599。 https://doi.org/10.1016/j.tips.2009.08.004 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ding, H. & Wu, F. 画像誘導による薬物の生体内分布と薬物送達。 セラノスティクス。 2(11)、1037–1039。 https://doi.org/10.7150/thno.5321 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Haemmerich, D. 非侵襲的な画像誘導による標的薬物送達。 ランセット・オンコル。 19(8)、1000–1001。 https://doi.org/10.1016/s1470-2045(18)30419-4 (2018)。

論文 PubMed Google Scholar

Haemmerich, D. & Motamarry, A. 画像誘導薬物送達のための感熱性リポソーム。 上級がん研究所 139、121–146。 https://doi.org/10.1016/bs.acr.2018.04.004 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Lamichhane, N.、Dewkar, GK、Sundaresan, G.、Mahon, RN & Zweit, J. 画像誘導薬物送達のための [(18)F]-フッ素化カルボプラチンおよび [(111)In]-リポソーム。 内部。 Ｊ．Ｍｏｌ． 科学。 18、5。 https://doi.org/10.3390/ijms18051079 (2017)。

記事 CAS Google Scholar

Phillips, WT、Bao, A.、Brenner, AJ & Goins, BA 放射線治療用ナノ粒子を用いた癌に対する画像誘導介入療法。 上級医薬品の配送。 黙示録76、39－59。 https://doi.org/10.1016/j.addr.2014.07.001 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, D. et al. ペプチド密度はトリプルネガティブ乳がんの転移を標的にし、転移を阻止します。 ナット。 共通。 9(1)、2612。https://doi.org/10.1038/s41467-018-05035-5 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kenchegowda、M.ら。 がん治療の新たなプラットフォームとしてのスマート ナノキャリア: レビュー。 分子 27、1。 https://doi.org/10.3390/molecules27010146 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Guo、P.ら。 ナノ粒子の弾性により腫瘍への取り込みが指示されます。 ナット。 共通。 9(1)、130。https://doi.org/10.1038/s41467-017-02588-9 (2018)。

論文 ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gunawan, R. & Auguste, D. in vitro で内皮を標的とする免疫リポソームは、脂質ラフトの形成に依存しています。 モル。 薬局。 2010 年、1569 ～ 1575 年。 https://doi.org/10.1021/mp9003095 (2010)。

記事 CAS Google Scholar

アロヨ・クレスポ、JJ 他トリプルネガティブ乳がん前臨床モデルの特性評価により、転移進行の機能的証拠が得られます。 内部。 J. キャンサー。 145(8)、2267–2281。 https://doi.org/10.1002/ijc.32270 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ラシッド、OM 他。 ヒト乳がん進行の改良された同系同所性マウスモデル。 乳がん研究所扱う。 147(3)、501–512。 https://doi.org/10.1007/s10549-014-3118-0 (2014)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Paschall, AV & Liu, K. 乳がんの自然転移の同所性マウスモデル。 J.Vis. 経験値 https://doi.org/10.3791/54040 (2016)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

アブ・リラ、AS、木和田、H. & 石田、T. 加速血液クリアランス (ABC) 現象: 臨床的課題と管理アプローチ。 J. コントロールリリース。 172(1)、38–47。 https://doi.org/10.1016/j.jconrel.2013.07.026 (2013)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

清水 達也 ほか PEG化リポソームのヒドロキシルPEGバージョンと、抗PEG IgM誘導およびPEG化リポソームのクリアランス促進に対するその影響。 ユーロ。 Ｊ．Ｐｈａｒｍ． バイオ医薬品。 127、142–149。 https://doi.org/10.1016/j.ejpb.2018.02.019 (2018)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Ishida, T. & Kiwada, H. PEG 化リポソームの繰り返し注射による血液クリアランス (ABC) 現象の加速。 内部。 Ｊ．Ｐｈａｒｍ． 354(1-2)、56-62。 https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2007.11.005 (2008)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

デサイ、TJ 他透過性ペプチドを同定するためのリポソームクリック膜透過性アッセイ。 薬局。 解像度 38(5)、843–850。 https://doi.org/10.1007/s11095-021-03005-z (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Qin, H. et al. 免疫療法を改善するために、生体内でのクリックケミストリーを介した活性リンパ節の蓄積を利用したがんワクチンの開発。 上級メーター。 33(20)、e2006007。 https://doi.org/10.1002/adma.202006007 (2021)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ワン、L.ら。 リポソームトロンボモジュリンの組換えおよび化学/生物直交合成およびその抗血栓活性。 Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ． バイオエンジ。 124(4)、445–451。 https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2017.05.008 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

松村 洋子、前田 宏 がん化学療法における高分子治療薬の新しい概念: タンパク質の腫瘍向性蓄積のメカニズムと抗腫瘍剤スマンクス。 がん研究所 46(12 Pt 1)、6387–6392 (1986)。

CAS PubMed Google Scholar

中村 裕、持田 A.、チョーケ、PL、小林 H. ナノドラッグデリバリー: 透過性と保持効果の向上は癌の治癒に十分ですか? バイオコンジュグ。 化学。 27(10)、2225–2238。 https://doi.org/10.1021/acs.bioconjchem.6b00437 (2016)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

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著者らは、トルクマン研究所の立ち上げ支援についてストーニーブルックがんセンターに感謝したいと思います。 さらに、この出版物で報告された研究は、Lynn november 慈善基金 (Turkman) によって部分的に支援されました。

ストーニー ブルックがんセンター、ストーニー ブルック、ロングアイランド、米国

Daxing Liu、ジュールズ・コーエン、ナシャート・トルクマン

放射線科およびがんセンター、ルネッサンス医科大学、ストーニーブルック大学、100 Nicolls Road、ストーニーブルック、ニューヨーク、11794、米国

Daxing Liu & ナシャート・トルクマン

米国ニューヨーク州ロングアイランド、ストーニーブルック大学医学部医学部血液腫瘍科

ジュールズ・コーエン

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著者全員が原稿をレビューし、研究設計、データ分析、原稿の執筆に貢献しました。 DLは実験を行いました。

ナシャート・トルクマン氏への通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Liu, D.、Cohen, J. & Turkman, N. PEG2000-DBCO 表面コーティングは、乳がん異種移植片によるリポソームの細胞内取り込みを増加させます。 Sci Rep 12、10564 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-14947-8

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受信日: 2022 年 4 月 3 日

受理日: 2022 年 6 月 15 日

公開日: 2022 年 6 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14947-8

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