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May 07, 2023

アルカンの構造と仕組み

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 2180 (2023) この記事を引用

4666 アクセス

21 オルトメトリック

メトリクスの詳細

アルカンは炭素の中で最もエネルギーが豊富な形態であり、環境中に広く分散しています。 微生物によるそれらの変化は、地球規模の炭素循環における重要なステップを表します。 膜貫通型金属酵素であるアルカン モノオキシゲナーゼ (AlkB) は、微生物媒介アルカン分解の最初のステップで直鎖アルカンをアルコールに変換し、それによって地球規模の炭素循環と石油のバイオレメディエーションにおいて重要な役割を果たします。 AlkB の生物多様性は、さまざまな鎖長のアルカンを酸化する能力に起因すると考えられていますが、個々の AlkB は比較的狭い範囲を標的としています。 基質選択性と触媒活性のメカニズムは依然として解明されていない。 今回我々は、膜酵素に独特の構造を提供する AlkB の低温 EM 構造を報告します。 私たちの構造と機能の研究により、予期せぬ二鉄中心配置が明らかになり、基質選択性の分子決定因子が特定されました。 これらの発見は、AlkB の触媒機構についての洞察を提供し、アルカン分解微生物における AlkB の機能に光を当てます。

炭化水素は遍在しています。 自然の浸出、石油産業からの偶発的放出、およびシアノバクテリアの生物学的活動の組み合わせによって、毎年最大 8 億トンが放出されています1、2、3。 これらの分子は炭化水素を代謝する細菌にとって豊富な食料源であり、生態系に大きな影響を与えます4,5。 したがって、炭素循環において不可欠なステップは、液体アルカンを生物学的に有用なものにするための酵素的変換である。

液体アルカンを代謝できる細菌は、赤道地域6,7から石油の影響を受けた湾8、北極と南極の炭化水素が豊富な自然のままの土壌7,9,10,11,12,13,14,15,16に至るまで、世界中で発見されています。 17、18、19、20、21、22。 これらの環境全体で、液体アルカンの酸化を触媒する主な酵素は、アルカン モノオキシゲナーゼ (AlkB) です。 AlkB はさまざまな直鎖アルカンを酸化し、アルカンを唯一の炭素源およびエネルギー源として使用するさまざまな細菌に広く分布しています10、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37。 実際、これは、ディープウォーター・ホライズンの石油流出後に急速に増殖した微生物群集で最も差次的に発現された遺伝子であった38。

AlkB は膜脂肪酸不飽和化酵素 (FADS) 様スーパーファミリーに属し、脂肪アシル脂肪族鎖を不飽和化または水酸化する非ヘムジ鉄モノオキシゲナーゼのグループを表します 39。 膜FADS様スーパーファミリーの触媒可塑性を反映して、AlkBは直鎖アルカンの末端メチル基を選択的に水酸化します。 ファミリーの他のメンバーは、それぞれ二重結合またはヒドロキシル基を脂質ベースの基質に導入します。 これらのユニークな生体触媒の構造を初めて垣間見たのは、哺乳類のステアロイル-CoA デサチュラーゼ SCD1 と酵母のスフィンゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼ Scs7p40,41,42,43 の構造によって得られました。 特徴的なヒスチジンに富むモチーフを除いて、AlkB はこれら 2 つの脂肪酸酵素ファミリーと顕著な配列類似性や電子伝達パートナーを共有しません。 AlkB の二鉄中心の正確な構成は依然として不明です。 機能的な AlkB は、結核菌 H37RV、レジオネラ ニューモフィリア株フィラデルフィア、緑膿菌 PAO131,36,44 などの病原菌でも同定されており、AlkB が病原体の増殖を促進する可能性があることが示唆されています 36。 20,000 を超える AlkB タンパク質配列が同定されており、これは微生物全体に広く分布していることを反映しています。

地球規模の炭素循環と人間の健康にとってその基本的な重要性にもかかわらず、AlkB の触媒機構は依然として謎に包まれており、酵素の構造はまだ実験的に決定されていません。 AlkB が脂肪酸酵素と区別され、直鎖アルカンの末端メチル基を選択的に水酸化できるようにする特徴は何か。 ある AlkB を他の AlkB と区別する特徴は何か。その結果、その AlkB ファミリー全体に、地球規模の炭素循環の基礎となる驚くほど幅広い基質範囲が与えられることになる。 情報が不足しているため、AlkB の構造がどのようにその機能を促進し、バイオテクノロジーへの応用を大きく妨げているかについての理解に大きなギャップが残されています。

AlkB は、周囲条件下でアルカンをアルコールに変換する機能が確立されている比較的少数の酵素の 1 つです (図 1a)。 これは、CH 結合の非極性と大きな解離エネルギー、および O2 の選択的活性化に伴う課題のため、化学的に困難な反応です。 他のアルカン酸化酵素には、粒子状銅含有メタンモノオキシゲナーゼ (pMMO)、ヘム含有シトクロム P450 酵素、2 つのフラビン依存性酵素 LadA および AlmA45、および別の非ヘム二鉄酵素である可溶性メタンモノオキシゲナーゼ (sMMO) が含まれます。 AlkB は、金属中心を取り囲む窒素に富んだリガンド環境を特徴とするため、アルカン酸化酵素の中でも独特です。 他の非ヘム二鉄酵素は、カルボン酸に富んだ鉄中心を持っています。 これは、AlkB が独特の触媒機構を持っていることを示唆しています。 数十年にわたる機能研究がこのメカニズムを解明することに成功していなかったため、私たちはその活性部位についての構造的洞察を得ようと努めました。

a アルカンの生物学的分解における重要なステップ。 AlkB は、アルカンをアルコールに変換することによってアルカン代謝を開始します。 b オクタンに対する FtAlkB のアルカン水酸化活性。 FtAlkB のオクタノール ピーク (黒) と FtAlkB を含まないネガティブ コントロール (赤) の代表的な GC-MS プロファイル。 実験は独立して 3 回繰り返され、同様の結果が観察されました。 精製タンパク質の活性は、225 ターンオーバー数、またはタンパク質 1 mg あたり 5 μモルの生成物に相当します。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 c ICP-MSによって決定されたFtAlkBの鉄占有率（NC、ネガティブコントロール;平均±SEM; n = 3の独立した実験）。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 d FtAlkB-ナノボディ複合体のクライオEM密度マップ。 e 膜に平行に見た FtAlkB の全体構造。 2 つの鉄原子がオリーブの球として示されています。

今回我々は、AlkB の低温 EM 構造と、それに付随するその触媒活性の特性評価を報告します。 私たちの研究は、この酵素ファミリーの構造、二鉄中心の重要な特徴、および基質選択性の分子決定因子を明らかにし、この重要だがとらえどころのない地球規模の炭素循環の推進力に関する50年以上のデータを照合するのに役立ちます。

AlkB の構造研究を促進するために、我々は AlkB 相同体の大規模なパネルの生化学的挙動を体系的に特徴付けました。 プロトタイプのシュードモナス・オレオボランスAlkB（GPo1AlkB、補足図1）と62％の配列同一性を共有するフォンティモナス・サーモフィラAlkB（FtAlkB）は、タンパク質収量と安定性の点で有望であることがわかりました（補足図2a）。 FtAlkBは、モデルアルカンオクタンに対して強力なアルカンヒドロキシラーゼ活性を示しました（タンパク質1mgあたり5μモルの産物）。これは、以前に特徴付けた最も活性なAlkB（Alcanivorax borkumensis AlkB46の場合、タンパク質1mgあたり4.5μモルの産物）に匹敵します（図1b）。 これらの特性により、FtAlkB は構造的および機構的研究の優れた候補としてマークされました。

AlkB の触媒活性は鉄に依存するため、誘導結合プラズマ質量分析法 (ICP-MS) を使用して FtAlkB の鉄含有量を測定しました。 我々の結果は、精製されたFtAlkBには鉄が負荷されている一方、対照タンパク質ではバックグラウンドを超える鉄は検出されなかったことを示した。 さらに、バックグラウンドレベルを超える亜鉛は検出されませんでした（図1c）。 これらの結果は、FtAlkB が鉄と特異的に結合することを示しています。 特定の鉄含有量は、以下に示す構造観察と一致して、タンパク質分子あたりおよそ 2 つの鉄イオンです。

AlkB 触媒反応の分子機構についての洞察を得るために、界面活性剤 n-ドデシル-β-d-マルトピラノシド (DDM、補足図 3 および補足表 1) で精製した FtAlkB について単粒子クライオ EM 研究を実施しました。 ）。 タンパク質の比較的小さいサイズ（45 kD）を克服し、粒子の整列を促進するために、FtAlkBに特異的に結合し、安定した複合体を形成するナノボディを開発しました（補足図2b）。 基準マーカーとしてナノボディを使用して、3.45 Åの解像度でFtAlkBの3D再構成を取得しました（FtAlkBのみにマスクを使用した場合、FtAlkBナノボディにマスクを使用した場合は3.59 Å）、FtAlkBの局所解像度は2.8に達します。 Å～3.2Å。 FtAlkB の高品質マップにより、タンパク質を明確に追跡し、モデルを構築することができました（図 1d、e、および補足図 4a）。

FtAlkB の構造は膜貫通ドメイン (TMD) と触媒ドメインから構成されます。 「ポジティブ内側」ルール 47 は、FtAlkB の N 末端と C 末端の両方が膜の細胞内側に存在し、触媒ドメインが細胞内に配置されることを予測します。 これは、おそらく触媒ドメインの近くで相互作用する酸化還元パートナーの細胞内位置と一致しています。 TMDでは、6つのTMが細胞質末端が互いに離れてテント状に配置され、触媒ドメインを収容するための大きな界面を形成しています（図1e）。 さらに、H2 ヘリックスと H3 ヘリックスは膜の途中に挿入されるリエントリー ループを形成します。 膜とサイトゾルの界面では、膜表面に平行な 3 本のらせんがサイトゾル ドメインを膜に固定し、構造要素を配置して活性部位の形成をサポートします。 TM4 と TM6 の細胞質末端は膜から突き出ており、2 つの鉄イオンを調整する 2 つのヒスチジンに富んだモチーフを提供します。 二鉄部位はさらに、他の2つのヒスチジンに富むモチーフが存在する2つの細胞質セグメント、つまりTM4とTM5の間のヘリックス-ターン-ヘリックス、および短いαヘリックスを備えた長いC末端によって囲まれています（補足図4g）。

Dali サーバー 48 を使用したタンパク質データ バンクの検索に基づくと、FtAlkB は実験構造を持つ他のタンパク質と顕著な構造類似性を共有していません。 AlkBは、脂肪酸デサチュラーゼSCD1やスフィンゴ脂質α-ヒドロキシラーゼScs7pなどのFADS様スーパーファミリーのものを含む、他の既知のタンパク質ファミリーとは実質的に異なるフォールドを表します（補足図4e-g）。

FtAlkBでは、2つの鉄イオンが、4つの保存されたヒスチジンに富んだモチーフからの9つのヒスチジン残基によって配位されています（図2aおよび補足図1）。 1つの鉄は5つのイミダゾール環によって配位され、もう1つは4つのイミダゾール環によって結合されています（補足図4b）。 これらのヒスチジン残基は種間で不変であり、GPo1AlkB39,49 の酵素機能に不可欠であることが判明しました。 両方の鉄の配位幾何学は、八面体配置のいくつかの特徴を示し、もう一方の鉄は配位子が欠落している軸に沿って現れます。 これにより、2 つの鉄イオンが約 5.4 Å 離れた状態になります。 私たちの構造は、AlkB の二鉄中心の窒素が豊富な環境を直接示しています。 これは、AlkB50 の以前の分光学的研究から推定された金属リガンドの正体を裏付けるものであり、他の既知の非ヘムジ鉄アルカンモノオキシゲナーゼで見られる酸素に富んだ配位とは顕著に対照的です。 また、AlkB と他の二鉄アルカンモノオキシゲナーゼ (sMMO など) との間の二鉄中心の構成における基本的な違いも観察しました。 まず、FtAlkB の 2 つのイオン間の距離は、sMMO の鉄間の距離 3 Å と比較して、約 5.4 Å と長くなります。 第二に、FtAlkB には架橋リガンドが観察されませんが、sMMO には 2 つの鉄イオンを架橋するカルボン酸基と水酸化基があります。 これらの重要な違いは、AlkB がアルカンの酸素化にこれまで報告されていない機構を使用している可能性があることを示しています。

a 二鉄配位の拡大図を含む FtAlkB の構造。 配位するヒスチジン残基と周囲のグルタミン酸塩を棒で示します。 b 保存されたヒスチジンモチーフのアラインメント。 c FADS様スーパーファミリーのメンバーにおける二鉄中心の重ね合わせ。

AlkB のこの二金属構造は、脂肪酸デサチュラーゼやスフィンゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼなど、FADS 様スーパーファミリーの他の脂質代謝タンパク質の観察によって裏付けられています。 AlkB はそれらと限られた全体配列と構造的類似性を共有していますが、AlkB の特徴的なヒスチジンに富んだモチーフは空間内で同様に組織されており、鉄配位ヒスチジン残基は脂肪酸デサチュラーゼやスフィンゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼの結合部位に似た二鉄結合部位を形成しています (図 1)。 2b、c)。 ヒスチジン残基間の間隔の変化は、異なるらせん構造によって補償されます。 これらの観察は、これらの窒素に富んだ二鉄中心の間である程度の共通の触媒機構が存在することを示唆している。

それにもかかわらず、重要な違いがあります。AlkB には、Fe1 (4 つのヒスチジン残基によって配位された鉄) の近くに保存されたグルタミン酸残基 E281 のカルボキシル基があり、その鉄および近くのヒスチジン残基と潜在的に相互作用する可能性があります。 E281 の鎖はクライオ EM マップでは十分に分解されていません。 対照的に、水分子はSCD1で同様の位置を占めていますが、Scs7pにはさらに1つのヒスチジンがあり、両方の鉄に対して5つのヒスチジン配位を形成しています（図2c）。 鉄の周囲環境におけるこうした違いは、鉄の反応性や反応中間体の安定性に影響を与える可能性があり、これらの酵素が触媒する異なる反応に役割を果たしている可能性があります。

不活性疎水性基質がどのようにして AlkB の活性部位に到達するかを理解することは、その炭化水素処理能力を解明するために重要です。 TM2、TM4、および TM6 は、TM ドメインから触媒ドメインに伸び、活性部位のすぐ上に達する細長い前庭を形成します。 前庭は主に疎水性残基によって裏打ちされており、前庭の直径はアルカン結合に適合します（図3a）。 興味深いことに、前庭を占める細長い管状の非タンパク質密度が見つかりました（図3bおよび補足図4c）。 管状密度の一端は活性部位の近くにあり、遠位端は W62 の近くにあります。 密度の形状はアシル鎖と互換性があり、周囲の疎水性残基はアルカンを収容するのに役立つ可能性があります。 長さの一致に基づいてドデカンを密度に暫定的に配置しましたが、この解像度では密度の分子同一性を明確に解決することはできません。 アルカンの端は、2つの鉄から同様の距離に位置しています（それぞれ約5.1Åと約5.7Å、補足図4d）。

a FtAlkBの基板チャネルのスライス図。 2 つの鉄原子がオリーブの球として示されています。 b ドデカンを当てはめたリガンド密度の拡大図。 主要なキャビティの残留物は棒で示されています。 c オクタンに対するFtAlkB変異体のアルカン水酸化活性、野生型に対して正規化（平均±SEM; n = 3の独立した実験）。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。

前庭内張り残基のうち、3 つのロイシン残基、L274、L315、および L318 は高度に保存されています（補足図 1）。 L274 と L318 は、アルカンの末端 (酸化部位) 付近で反対側からアルカンと相互作用します。 したがって、これら 2 つの残基は、触媒反応のためにアルカンを適切に配置するのに役立ちます。 疎水性空洞の遠位部分に位置するL315もアルカンと接触します（図3b）。 さらに、保存された L315X2L318 モチーフは、疎水性ヘリックス (H4) を最後のヒスチジンに富むモチーフ (H321X2HH325) に結合します。 我々の機能研究では、L274またはL318をトリプトファンに置換すると、FtAlkBの触媒活性が消失した（図3c）。 一方、L315W 置換は活性にほとんど影響を与えませんでした。 これらの結果は、L274 および L318 の側鎖サイズの重要性を強調しており、活性部位の基質の位置決めにおけるそれらの提案された役割と一致しています。 L315 が位置する基質チャネルの遠位領域は、触媒作用中のより大きな変動に対応できる可能性があります。

基質前庭では、W62 が戦略的な位置に位置し、アルカンの最後のセグメントに詰め込まれています。 W62 と L141 (反対側からアルカンの末端と相互作用する) は、前庭の狭い部分を定義します。 この狭い領域は、炭素数 12 を超えるアルカンを受け入れるのに障害となる可能性があります。 注目すべきことに、以前の研究では、GPo1AlkB (W55) における W62 の同等の位置が、アルカン上で増殖する細菌の異なる能力と相関していることが示されました。GPo1AlkB と、この位置にあるトリプトファンとの類似体は、炭素数 5 ～ 12 のアルカン上で増殖できます。最適なアルカン鎖長は 8 に近い値です。対照的に、同じ位置に小さな疎水性残基 (A、V、L、または I) を持つ AlkB は、より長いアルカン、特に少なくとも 12 個の炭素を有するアルカンを代謝できます 44,49,51 。 これらの観察は、W62 の重要な役割と一致しています。

基質チャネルを制限する残基が基質選択性を決定するという仮説をさらに検証するために、炭素数5〜14の範囲のアルカンに対するFtAlkBとそのW62V変異体の活性を評価しました（図4a、bおよび補足図5a）。 FtAlkB は炭素数 6 ～ 12 のアルカンに対して活性を持ち、ヘプタンとオクタンに対して最適な活性を示します。 炭素数が 12 を超えるアルカンについては、検出可能な活性は観察されませんでした。 W62V バリアントは基質選択性を明らかに変化させました。デカン、ウンデカン、ドデカンなどの長鎖アルカンに対する相対活性が大幅に増加しました。 W62V 変異体は、トリデカンとテトラデカンも酸化する可能性があります。 GPo1AlkB を使用した実験でも同様の傾向が示されました (補足図 5b)。 興味深いことに、D. cinnamea AlkB に関する最近の突然変異誘発研究では、FtAlkB の W62 に相当する位置にあるそれほど嵩張らないアミノ酸をより嵩高いアミノ酸 (V91W) に変更すると、より長いアルカンに対する活性が低下することが示されました 52。 これらの結果は、この位置の側鎖サイズが最適な基質の長さを決定する際に重要な役割を果たしていることを強調しています。

a、b 炭素数5〜14の直鎖アルカンに対するWT（a）およびW62V（b）のアルカンヒドロキシル化活性（平均±SEM; WTについてはn = 4の独立した実験、W62Vについてはn = 3の独立した実験）。 ソース データはソース データ ファイルとして提供されます。 c 基質の侵入または生成物の放出のための潜在的な側方経路。 ドデカンはオレンジ色で表示されます。 重要な残基はシアン色の棒で示され、選択された短いヘリックスは赤色で示されます。

これらの結果はすべて、イブニング用の長い手袋が手や腕にしっかりとフィットし、その中に滑り込むのと同じように、各 AlkB がその標的アルカンのサイズに厳密に一致する基質チャネルを進化させたというモデルと一致しています。

FtAlkB の構造は、この重要な酵素ファミリーの構造を明らかにします。 AlkB は、膜脂肪酸不飽和化酵素やスフィンゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼと全体的に保存された二金属配位構造を共有しながら、これまで実験的に観察されたことのないタンパク質の折り畳みを採用しています。 AlphaFold53モデル（AF-A0A1I2KHB9-F1）は、FtAlkB構造（二乗平均平方根偏差（rmsd）= 1.163Å、補足図4e）とよく一致し、未知の構造折り畳みを予測する能力を示しています。 一方で、AlphaFold の予測構造には金属イオンが欠如しているため、その触媒作用に関する洞察は限られています。

私たちの構造と機能の研究は、AlkB がどのように基質選択性を達成するかについて重要な洞察を提供します。 基質の末端メチル基は二鉄活性部位の近くに位置しています。 活性部位から約 13 Å 離れた嵩高いアミノ酸により、炭素数約 8 のアルカンを優先的に酸化する AlkB と、より長いアルカンを効率的に酸化する (そして付随して短いアルカンの酸化効率が低下する 54) AlkB が区別されます。AlkB は、その位置にそれほど嵩張らない残基を持っています。 嵩高いアミノ酸は、より長いアルカンに対する障壁として機能すると同時に、最適なサイズの非極性アルカンを所定の位置に保持するのにも役立つ可能性があると考えられます54。 潜在的には、基板チャネルの他の構造的特徴が追加の識別を提供する可能性があります。 したがって、私たちの構造は、バイオテクノロジー用途向けに AlkB を設計する将来の取り組みの基盤を提供します。

私たちの AlkB 構造では、基質の遠位端を固定する TM2 はサイトゾル側の隣接する TM と相互作用せず、脂質二重層に横方向の開口部が残ります。 各開口部は膜に平行な疎水性ヘリックスによって保護されており、基質の進入または生成物の放出を可能にするゲートの可能性を示唆しています（図4c）。 これは、TM2 が基質がチャネルに進入し、生成物がチャネルから出ることを可能にする側方経路を制御している可能性があることを示唆しています。 このような横方向のゲートにより、膜に分割されたアルカンが、形状が一致した AlkB の基質チャネルを介して活性部位に到達できるようになります。 同様に、反応後、アルコール生成物は同じ経路を通じて放出され、脂肪酸酸化システムを介してさらに酸化され、細菌にエネルギーと炭素源を提供します。

選択的な CH 結合の活性化は化学の聖杯です 55。 したがって、FADS 様スーパーファミリーのメンバーが CH 活性化化学をどのように行うかは、長い間強い関心を集めてきました。 私たちの構造は、このプロセスに関する貴重な洞察を提供します。 私たちの構造では、AlkB は末端メチル基を二鉄活性部位の近くに配置します。 脂肪酸不飽和化酵素では、内部の CC 結合が不飽和化されるように配置されています。 これらの観察を総合すると、FADS 様スーパーファミリーのメンバーは、切断される結合が活性部位に隣接するように基質チャネル内に長鎖アルキル基質を配置していることが示唆されます。 触媒作用により、分岐して不飽和化または水酸化できる共通の高価中間体が生成されると考えられています。

我々や他の研究者らは、FADS様スーパーファミリーが、よく特徴づけられている他の二鉄CH活性化酵素であるsMMO54,56,57,58,59の化合物Qと同様の触媒能力のある中間体を生成するという仮説を立てた。 AlkB の 2 つの鉄イオンが電子的に結合し、強い CH 結合から水素原子を引き抜くのに必要な電子不足の中間体を共有する際にエネルギー的に有利になると考えられていました。 予想外なことに、我々の構造は、AlkB の窒素に富む活性部位が 2 つの鉄イオン間の距離が長く、架橋配位子を欠いていることを示しています。 この構造は、sMMO の酸素に富んだ非ヘム二鉄中心とは根本的に異なります。 代わりに、AlkB の活性部位は、膜脂肪酸デサチュラーゼおよびスフィンゴ脂質 α-ヒドロキシラーゼの活性部位に似ています (これら 2 つの酵素に結合した鉄または偶発的に組み込まれた亜鉛イオンに関係なく)。 異なる条件下で複数の異なる酵素から観察されたこれらの同等の活性部位構成は、FADS様スーパーファミリーのヒスチジン残基によって形成される二鉄中心がsMMOの中心とは十分に異なり、異なる触媒中間体を必要とすることを強く示唆している。

ここで提示された構造を、私たちのグループによる以前の機構研究と組み合わせることで、AlkBの機構を推測することができます46、54、58、59、60、61（補足図6）。 2つの鉄イオン間で観察された長距離は、2つの鉄が異なる役割を果たす機構を示唆しており、一方の鉄は電子リレーと水結合の部位として機能し、もう一方の鉄イオンは触媒部位として機能する。 鉄上の Fe(II)-OH2 種から O2 が結合している 2 番目の鉄イオンへのプロトン結合電子移動 (PCET) により、ペルオキソ第二鉄種と水酸化第二鉄種が形成され、これらは容易にプロトン化されます。 OO 結合のヘテロリシス開裂により、一方の鉄、水上に第二鉄ヒドロキソ種が形成され、もう一方の鉄上に触媒能力のある Fe(V) オキソが形成されます。 この仮説を裏付けるのは、AlkB と同程度に長い基質ラジカル寿命を持つもう 1 つの金属酵素がナフタレンジオキシゲナーゼ (NDO) であり、形式的には Fe(V) オキソ種が活性種であると仮定されているという事実です 62。 Mn(V) オキソ種で見られたように、反発種 (AlkB、Fe(IV)-OH の場合) の電子構造はラジカルの寿命に影響を与えます 63。 また、我々の構造では見られない、反応中に活性部位の実質的な再配置が存在する可能性も残されており、これにより、より sMMO に似た反応機構が生じる可能性があります 64。 反応中間体の詳細な分光学的特性評価は、今後の研究の対象となるでしょう。

FtAlkB (アミノ酸 4 ～ 399) をコードする DNA をコドン最適化し、pRSF ベクター (Novagen) にクローニングしました。 このタンパク質は大腸菌 BL21 (DE3) で過剰発現されました。 細胞を 37 °C で増殖させ、10 mg/L Fe3+ の存在下、30 °C で 5 時間、0.2 mM IPTG によって誘導しました。 ペレット化した細胞を溶解緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール）に再懸濁し、超音波処理により破壊した。 FtAlkB を 1% DDM (Anatrace) により 4 °C で 1 時間可溶化し、その後コバルト樹脂により清澄上清から単離しました。 3 C プロテアーゼで一晩消化した後、FtAlkB 溶出液をナノボディ AP32 と 1:2 のモル比でインキュベートしました。 複合体を、20 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、および0.02% DDMを含む緩衝液中でSuperdex 200増加カラム(GE Healthcare)上のサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって精製し、クライオEM分析に供した。

AlkBを発現する細胞を遠心分離し、溶解バッファーに再懸濁し、フレンチプレスで高圧を1回通過させて破壊し、7000×gで20分間遠心分離しました。 ０．５ｍＬの細胞上清に、ＡｌｋＧおよびＡｌｋＴを発現する細胞からの０．５ｍＬの細胞上清および２μＬの精製基質を添加した。 反応は、12.3 mMの使用濃度を達成するのに十分なNADHを添加することによって開始した。 アッセイは振とうしながら 37 °C で 30 分間インキュベートしました。 インキュベーション期間の終わりに、反応を100μLのCHCl3で停止させた。 混合物を 1 分間ボルテックスし、16,200 × g で 5 分間遠心分離しました。 有機層を移し、Agilent 5977E 質量選択検出器 (MSD) を備えた Agilent 7820 A ガスクロマトグラフィーに注入しました。 1 μL のサンプルを、インジェクター温度 275 °C、スプリット比 25:1 で Agilent HP-5 カラムに注入しました。 オーブンの初期温度は 45 °C、保持時間は 2.25 分でした。 次に、オーブンの温度を 10 °C/分の速度で最終温度 225 °C まで上昇させました。 各化合物の同一性は、各ピークの断片化パターンを、同一条件下で注入され、同時に溶出された本物の標準の断片化パターンと手動で比較することによって決定されました。 ピーク強度は、MSD ChemStation F.01.03.2357 を使用して全イオン電流 (TIC) を手動で積分することによって決定されました。 すべての活性アッセイには、基質 + 緩衝液によるコントロールと、AlkG、AlkT、NADH、および基質によるコントロールが含まれていました。 精製タンパク質は、精製 AlkG、トウモロコシ フェレドキシン レダクターゼ、および NADPH を使用したことを除き、同様の方法でアッセイされました 46,65。

精製タンパク質を 50% HNO3 中で一晩消化し、その後 30 分間煮沸しました。 サンプルをミリ Q 水で 5% HNO3 に希釈し、ICP-MS 分光計 (Thermo Scientific XSERIES 2) に供しました。 AlkB タンパク質とネガティブコントロールである鉄を含まない semiSWEET トランスポーターを並行して調製しました。 校正には鉄標準を使用しました。

FtAlkB 特異的ナノボディは、公開されたプロトコル 66,67 に従って合成ナノボディ ライブラリから生成されました。 3 回の選択操作の後、個々のナノボディ候補の配列が決定され、大腸菌 BL21 (DE3) で発現されました。 精製されたナノボディは、プルダウン アッセイおよび分析 SEC を通じて FtAlkB への結合能力によって検証されました。 ナノボディ AP32 は、FtAlkB と安定した複合体を形成することが確認されました。 この複合体はクライオ EM 研究に供されました。

サンプル調製のために、3 μL の濃縮 FtAlkB (19 mg/ml) を、新たにグロー放電させた穴あきカーボン グリッド (Quantifoil Au R1.2/1.3 300 メッシュ) 上で 5 秒間インキュベートし、ブロッティング (時間 3、力 3) してから、 Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific) を使用し、湿度 100%、4 °C で液体エタン中で極低温冷却しました。 グリッドは、Falcon 4 検出器および Selectris エネルギーフィルター (スリット幅 10 eV) を備えた 300 kV Titan Krios でスクリーニングされました。 8.14 秒の露光時間中に、EPU ソフトウェア (Thermo Fisher Scientific) によって、物理ピクセル サイズ 0.95 Å、デフォーカス 1.6 μm ～ 2.2 μm、電子露光量 50 電子/Å2 で 50 個のムービー フレームが収集されました。

合計 5,072 本の映画が MotionCorr268 によって動き補正され、線量加重画像と合計画像が得られました。 線量加重画像はインポートされ、cryoSPARC v3.369 で処理されました。 画像のコントラスト伝達関数 (CTF) は、パッチ CTF 推定によって推定されました。 CTF 解像度が 8 Å を超える画像が選択され、4,965 枚の画像が得られました。 半分のデータセットは、ブロブ ピッカーから生成されたテンプレートによる自動選択に使用されました。 2D 分類後、Topaz v0.2.470 でのトレーニングに、さまざまなビューを持つ 51,617 個の粒子が使用されました。 続いて、合計 1,739,854 個の粒子が 160 ピクセルのボックス サイズおよび 2 × 2 ビニングで抽出され、2D 分類、不均一精製、および Ab-Initio 再構成が行われました。 明確に定義された 242,089 個の粒子のサブセットが 224 ピクセルのボックス サイズで再抽出され、12 Å の初期ローパス解像度の設定で粒子ごとのスケールでの最小化が有効になった不均一精製で 4.47 Å のマップが得られるように精製されました。そして追加のファイナルパスが5回。 密度をさらに向上させるために、シード促進ガイド付きマルチリファレンス 3D 分類が実行されました 71。 マルチリファレンスには、Ab-Initio 再構成によって生成された正確で偏ったリファレンス、解像度勾配マップ (4.47 Å マップと、10 Å と 20 Å のローパス フィルター処理された解像度を持つ他の 2 つのマップ)、およびノイズ再重み付けマップ (4.47 Å) が含まれます。マップと他の 2 つのマップでは、ミセルが 0.3 と 0.7 の係数でスケールダウンされました)。 Ab-Initio 再構成と重複粒子の除去後、253,772 個の粒子が再抽出され、ノイズ再重み付けマップのみを使用して不均一精製が行われ、結果は 3.84 Å になりました。 結果として得られた 145,869 個の粒子と、最初の処理で得られた 242,089 個の粒子が結合されました。 重複は、1 ラウンドの異種改良後に削除されました。 さらに 2 回の不均一精製を行った後、合計 107,776 個の粒子から 3.72 Å のマップが得られました。 最終マップは、ローカル リファインメントおよびローカル CTF リファインメントを介して、FtAlkB ナノボディの場合は 3.59 Å、FtAlkB の場合は 3.45 Å で再構築されました (FSC = 0.143)。 このマップは、ナノボディ密度を向上させるために DeepEMhancer72 によって、リガンド密度を向上させるために crioSPARC によってそれぞれ鮮明化されました。 ローカル解像度は、cryoSRARC の BlocRes によって計算されました。

AlphaFold253 FtAlkB モデルは Chimera の密度に適合し、Coot73 で手動で再構築されました。 PDB 7SL8 のナノボディ モデルをクライオ EM マップに当てはめ、AlphaFold2 予測を利用して相補性決定領域 (CDR) を手動で再構築しました。 FtAlkB ナノボディ モデルは Phenix74 で洗練され、MolProbity によって評価されました。 補足表 1 で報告されるリファインメント統計は、DeepEMhancer シャープ化マップに基づいています。 図は、PyMOL (Schrödinger, LLC)75、UCSF Chimera76、または ChimeraX77 を使用して作成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究を裏付けるデータは、要求に応じて対応著者から入手できます。 FtAlkB ナノボディ マップは、アクセッション コード EMD-40303 (FtAlkB ナノボディ) で電子顕微鏡データ バンク (EMDB) に寄託されています。 FtAlkB ナノボディ モデルは、8SBB の下のタンパク質データ バンク (PDB) にあります。 以前に公開された構造モデルは、アクセッション コード 6WF2、4ZR1、7SL8 を使用して PDB からダウンロードされました。 この文書には、図 1b、c、3c、4a、b、および補足図 5b が提供されています。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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リファレンスをダウンロードする

活性アッセイの開発に協力してくれた Jacob Austin に感謝します。 過去 20 年間にわたり、AlkB の構造と機能について有意義な議論を行ってくれたオースティン グループの多くの学生に感謝します。 ICP-MS データ収集にご協力いただいた Jamie Ross に感謝します。 SW と JL はベックマン フェローシップの受賞者でした。 NSF が資金提供した環境生物無機化学センター (CEBIC NSF9810248) の一環として AlkB に関する研究室での研究が始まり、この研究への知的関与は非常に貴重であった Jay T. Groves 教授に特別な謝意を表します。 この研究は、NIH R01 GM130989 (RNA & LF) の支援によって可能になりました。 AlkB の大規模スクリーニングに使用される初期 DNA の購入資金は、バーナード大学からの RNA に対する大統領研究賞から出されました。 この研究の一部は、NIH 共通基金の変革的高解像度クライオ電子顕微鏡プログラム (U24 GM129541) の支援を受けて、スタンフォード SLAC クライオ電子顕微鏡センター (S2C2) で実施されました。 オースティンの研究室での研究への支援は、ロイとダイアナ・ヴァゲロス夫妻からの寛大な贈り物によるものであり、私たちもそれを感謝しています。

ジュリエット・リー

現在の住所: カリフォルニア工科大学生化学および分子生物物理学科、パサデナ、カリフォルニア州、91125、米国

ショシャナ・C・ウィリアムズ

現在の住所: スタンフォード大学化学科、スタンフォード、カリフォルニア州、94305、米国

アリソン・フォースバーグ

現在の住所: 南カリフォルニア大学化学科、ロサンゼルス、カリフォルニア州、90007、米国

これらの著者は同様に貢献しました: Xue Guo、Jianxiu Zhang、Lei Han。

分子細胞生理学、スタンフォード大学医学部、スタンフォード、カリフォルニア、94305、米国

Xue Guo、Jianxiu Zhang、Lei Han、Yan Xu、Liang Feng

化学科、バーナード大学、3009 ブロードウェイ、ニューヨーク、ニューヨーク、10027、米国

ジュリエット・リー、ショシャナ・C・ウィリアムズ、アリソン・フォースバーグ、レイチェル・ネアフッド・オースティン

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XG と JL は、初期スクリーニングと候補者の検証を実行しました。 XG、LH、JZ はクライオ EM 研究を実施しました。 XG、LH、および YX は ICP-MS を実行しました。 JL、SW、AF、RNA は機能研究を実施しました。 RNA と LF がプロジェクトを監督しました。 XG、RNA、LFが原稿を書きました。

Rachel Narehood Austin または Liang Feng への通信。

著者らは競合する利害関係がないことを宣言します。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Rhys Griter と他の匿名の査読者に感謝します。 査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Guo, X.、Zhang, J.、Han, L. 他。 アルカン酸化酵素 AlkB の構造とメカニズム。 Nat Commun 14、2180 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-37869-z

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受信日: 2023 年 3 月 23 日

受理日: 2023 年 4 月 3 日

公開日: 2023 年 4 月 17 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37869-z

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