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Sep 08, 2023

細菌における新たなコレステロール生合成

Volume sulle comunicazioni sulla natura

Nature Communications volume 14、記事番号: 2904 (2023) この記事を引用

1632 アクセス

15 オルトメトリック

メトリクスの詳細

真核生物は、真核生物の生理学に不可欠な、コレステロールなどの高度に修飾されたステロールを生成します。 ステロールを生成する細菌種はほとんど知られていないが、細菌におけるコレステロールまたは他の複合ステロールの新規生成は報告されていない。 今回我々は、海洋粘液細菌Enhygromyxa salinaがコレステロールを生成することを示し、さらなる下流の修飾の証拠を提供する。 バイオインフォマティクス分析を通じて、我々は真核生物の経路とほぼ相同な大腸菌サリナにおける推定上のコレステロール生合成経路を同定した。 しかし、実験的証拠は、C-4での完全な脱メチル化が独特の細菌タンパク質を通じて起こり、細菌と真核生物のコレステロール生合成を区別することを示しています。 さらに、シアノバクテリア Calothrix sp. からのタンパク質。 NIES-4105 は C-4 位のステロールを完全に脱メチル化することもでき、他の細菌門でも複雑なステロール生合成が見られる可能性があることを示唆しています。 我々の結果は、真核生物に匹敵する細菌のステロール生産における認識されていない複雑さを明らかにし、細菌ドメインと真核生物ドメインにおけるステロール生合成の間の複雑な進化的関係を浮き彫りにする。

ステロールは、細胞シグナル伝達、膜恒常性、発生タイミングなどのさまざまな生理学的機能において重要な、遍在性の必須真核生物脂質の一種です1、2、3。 真核生物のステロール生合成は広範囲に研究されており、不飽和、脱メチル化、およびアルカリ化のレベルが異なる同様のステロール最終生成物を生成するために使用される共通の酵素セットを含む複雑な生合成経路が明らかにされています4,5。 これらの生合成経路における反応の順序は、脂質恒常性 6,7、下流生成物生合成 8、およびストレス応答 9 において調節的役割を果たすステロール中間体の生成と蓄積を決定します。 脊椎動物のコレステロール、植物のフィトステロール、真菌のエルゴステロールを合成するために必要な化学修飾は、これらの脂質の生物物理学的特性に不可欠であり、それぞれの生物の局在化と膜動態に影響を与えます10、11、12。 これらのステロールは、下流の代謝産物生合成の分岐点としても機能します。 酸化反応は、ステロールをオキシステロール、胆汁酸、ステロイドホルモン、ブラシノステロイドなどの幅広い化合物に変換するのに関与しており、これらはすべてさまざまなシグナル伝達経路のリガンドとして機能します13、14、15。 真核生物はまた、ステロールを糖、タンパク質、その他の脂質に結合させ、細胞防御、エネルギー貯蔵、消化、シグナル伝達を含むステロールの機能をさらに拡張します16、17、18。 全体として、真核生物のステロール生合成の複雑さは、これらの脂質が真核生物の生理学において果たす多様な機能と重要な役割を反映しています。

ステロールの生合成と機能は真核生物においてよく研究されていますが、細菌のステロール合成と機能は比較的十分に研究されていません。 好気性メタノトローフ菌、プランクトミセテス、およびさまざまな粘液細菌を含むいくつかの細菌は、ステロールを新たに生成することが知られている19。 真核生物とは異なり、これらの細菌は主に、オキシドスクアレン シクラーゼ (OSC) の初期環化生成物であるラノステロール、パルケオール、またはシクロアルテノールを生成します20、21、22。 ただし、一部の細菌はステロール合成中に追加の化学修飾を行います。 メタノトローフ細菌はステロールをメチロコッカス科に特有の異なるモノメチル化構造に修飾し 19、ステロールを生産するプランクトミセテスはステロールを未確認の高分子に結合させ 21、いくつかの Myxoccota 23 はザイモステロールを含むコレステロール生合成経路の中間体を生成します 19、22、24。 さらに、系統ゲノミクス研究により、潜在的な細菌ステロール生産者の数が拡大し、細菌ドメイン全体にわたる門の環化と下流修飾の両方に必要な遺伝子が同定されています 25,26。 これらの細菌のいくつかは、コレステロールを含む真核生物に関連する生合成的に複雑なステロールを生成する遺伝的可能性を秘めていますが、脂質分析では細菌におけるこれらのステロールの存在はまだ確認されていません5。

複雑なステロール生成のゲノム能力と細菌内で観察されたステロールとの間の矛盾により、我々はステロール生成細菌のより包括的な脂質分析に着手することになった。 これまでの系統発生研究と海洋粘液細菌 Enhygromyxa salina のステロール生合成遺伝子に関する我々自身の初期分析により、これまでに観察されたものよりも生合成的に複雑なステロールが生成される可能性が示唆されました。 我々は、これまでの分析では、限られたバイオマスおよび/または不適切な脂質抽出技術により細菌のステロール在庫が過小評価されていた可能性があると仮説を立て、この細菌のステロールを再分析する動機となった。 同様に、シアノバクテリア Calothrix sp. の分析も行われます。 NIES-4105 ゲノムは、複雑なステロール生合成に必要な遺伝子を含む推定上のステロール生合成遺伝子のクラスターを同定したため、我々はステロール分析をこの細菌にまで拡大することになりました。

この研究では、大腸菌サリナのステロール分析を再検討し、コレステロールを合成する能力を明らかにしました。 私たちのバイオインフォマティクス分析により、真核生物のコレステロール生合成のステップのすべてではないが一部の相同体が同定され、細菌のコレステロール生成と真核生物のコレステロール生成が区別されました。 さらに、真核生物のステロール生合成における必須のステップである C-4 での完全な脱メチル化が E. サリナの異なる細菌タンパク質を介して起こること、および系統発生的に異なるステロール生産細菌である Calothrix に見られるホモログが同様に機能することを実証します。 まとめると、これらの系統発生的に異なる細菌におけるステロール生合成の我々の分析は、細菌のコレステロール生成を支える複雑な生物学を示唆しており、ステロール生合成、進化、および機能についてのより広範な疑問を提起している。

我々は以前、粘液細菌 Enhygromyxa salina の脂質抽出物における、コレステロール合成の生合成中間体であるザイモステロールの生成を実証しました 19。 しかし、E. サリナは社会的捕食性細菌であり、全細胞酵母を含む固体寒天培地上で培養されることが多く、広範な脂質分析に利用できるバイオマスの量が制限されます 27。 これらの培養条件は、寒天と補助酵母の両方にステロールが含まれている可能性があるため、ステロール汚染の潜在的な原因にもなります。 この生物のステロール在庫をより適切に評価するために、我々は、自然にステロールを生成しない全細胞大腸菌を補充した液体培地で大腸菌サリナを増殖させた。 これらの培養条件により、抽出可能な脂質が 50 倍に増加し、より広範な分析が可能になりました。

我々はまず、Bligh-Dyer 抽出によって E. salina バイオマスから遊離脂質を抽出しました 28。 これらの最初の分析により、コレステロールを含むさまざまなステロールが明らかになりました（図1a、補足図1、補足図2）。 また、C-14 のみが脱メチル化される中間体である 4,4-ジメチルコレスタ-8,24-ジエノールも検出されました。これは、E. salina が菌類や動物と同様に、C-4 脱メチル化の前に C-14 脱メチル化を行うことを示しており、C-14 の除去後ではないことが示されています。植物のような最初の C-4 メチル基 5. また、ザイモステロール、コレスタ-7,24-ジエノール、デスモステロールなど、C-24 で不飽和の下流中間体もいくつか検出されましたが、C-24 で飽和した中間体は検出されませんでした。 C-24不飽和中間体のみの蓄積は、E.サリナがブロッホコレステロール生合成経路に有利であることを示唆しており、C-24の還元はコレステロール生合成の最終ステップとして起こります（補足図3）29。 コレステロールおよび中間体のデスモステロールおよびザイモステロールの定量により、中間体の濃度がコレステロールと同等またはコレステロールより高いことが明らかになりました（補足表1）。 最後に、潜在的な汚染を制御するために、培養培地と濃縮された補足大腸菌の両方を細菌バイオマスなしで抽出しました。 培地と抽出コントロールの両方にはステロールがありませんでした（補足図4）。

a 修正された Bligh Dyer 手順を使用して抽出された E. サリナからの遊離ステロールのトータル イオン クロマトグラム。 同定されたステロールには、コレステロール (VII) および C-24 不飽和中間体 (I-VI) が含まれていました。 b 酸加水分解によって E. サリナ脂質抽出物から放出されたエーテルおよびエステル結合ステロールのトータル イオン クロマトグラム。 加水分解により、25-ヒドロキシコレステロール (VIII) およびその他の推定ヒドロキシステロール (アスタリスクで示す) を含む追加のステロールが放出されました。 すべての脂質はトリメチルシリル基に誘導体化されました。 同定されたステロールの質量スペクトルを補足図 1に示します。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

潜在的なステロール複合体について E. サリナを評価するために、エステル結合脂質を切断するメタノール塩基、またはエステルおよびエーテル結合脂質を切断するメタノール酸のいずれかを使用して、総脂質抽出物 (TLE) と細胞バイオマスの両方を加水分解しました。 メタノール塩基によるTLEの加水分解では追加のステロールは放出されませんでしたが、メタノール酸による加水分解では25-ヒドロキシコレステロール（25-OHC）、追加のオキシステロールおよび他の潜在的な修飾ステロール化合物が放出されました（図1bおよび補足図5）。 TLE の酸加水分解後にオキシステロールが存在するが、塩基加水分解後にはオキシステロールが存在しないことは、これらの共役がエーテル結合によって媒介されていることを示唆しています。 ステロール複合体の化学的性質をさらに特徴付けるために、Si ゲルカラムクロマトグラフィーを使用して抽出可能な脂質を極性ごとに分離し、メタノール酸で加水分解した画分を分離しました。 加水分解後、ヒドロキシステロールを含むすべてのステロールはアルコール画分にのみ存在し、共役ステロールは遊離ステロールと極性が類似していることを示唆しています。 メタノール性塩基または酸による細胞バイオマスの直接加水分解では、E.サリナのステロールプロファイルは加水分解されたTLEのプロファイルから変化しませんでした。 これらの追加のステロールが加水分解中の分解または自動酸化の生成物ではないことを確認するために、まずコレステロールおよびデスモステロール標準物質を酸加水分解しましたが、ヒドロキシステロールの生成は検出されませんでした。 また、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）を大腸菌サリナ酸加水分解抽出物に添加しましたが、BHTを含まない抽出で観察された25-ヒドロキシコレステロールおよびその他の潜在的な修飾ステロールが依然として検出されました（補足図6）。

E.サリナによるコレステロールの生成は、そのゲノムにおける推定上の生合成経路の探索を我々に促した。 我々は、真核生物および細菌のステロール生合成タンパク質に対して BLASTp 検索 (<1 × e-30、30% ID) を実施しました 4,31。 コレステロール生合成経路のタンパク質はステロール生合成以外の機能を含む大きなスーパーファミリーに属しているため、同定されたタンパク質がステロール生合成に関与している可能性が高いことをより確実にするために、これらのBLASTp検索に対して制限的なカットオフを選択しました5。 E.サリナのゲノムにおける真核生物のコレステロール生合成経路のほぼすべてのステップの相同体を検出しました（図2および補足表2）が、同定されたタンパク質が細胞内で追加の反応を行わないことを証明するには、さらなる生化学的特徴付けが必要です。 注目すべきことに、ステロール生合成遺伝子は、他のステロール産生細菌で観察されるような遺伝子クラスターに局在せず 32 、代わりにゲノム全体の別の遺伝子座に見出されます（補足図7）。 この新たに構築されたコレステロール生合成経路を使用して、我々は次に、ステロール生成のゲノム能力が実証された他の細菌の相同体を検索した（<1 × e-50、30% ID）。 我々は、ステロール生合成の最初の段階であるスクアレンモノオキシゲナーゼ（SMO）とオキシドスクアレンシクラーゼ（OSC）を用いて103の細菌分離株と21のメタゲノムを組み立てたゲノムを同定した。 細菌ゲノムとメタゲノムを含むこれらのOSCおよびSMOのうち、真核生物のコレステロール生合成経路に必要なホモログを共有しているのは、配列決定されたE.サリナの他の分離株のみであり、コレステロール生成がこれらのE.サリナ種の共通の特徴である可能性が高いことを示しています（補足データ1）。 。

コレステロール生合成に関する標準的な真核生物タンパク質の相同体は、BLASTp検索によって同定されました（<1×e-30、30％ID;補足表2）。 E. salina バイオマスで同定されたステロールは太字で示されています。 E.サリナには、C-4脱メチル化およびC-25ヒドロキシル化を担う真核生物の酵素に対する相同体がありません。 完全な C-4 ステロール脱メチル化および C-25 ヒドロキシル化のための細菌酵素は同定されておらず、疑問符で示されています。 同定されたE.サリナ遺伝子のゲノムコンテキストを補足図7に示します。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

E.サリナは、そのコレステロール生合成経路の多くを真核生物と共有しているが、C-4脱メチル化を担う3つの真核生物タンパク質に対する相同体を持っていない。 代わりに、E.サリナは、好気性メタノトローフ生物がC-431の単一のメチル基のみを除去するために使用する、ジオキシゲナーゼ-レダクターゼペアであるSdmABのホモログを持っています。 E.サリナSdmABホモログが、コレステロールの生成に必要なC-4の両方のメチル基を除去するのに十分であるかどうかをテストするために、基質ラノステロールを過剰生産するように操作された大腸菌株における異種発現系を採用しました（図3a） ）33． SdmA ホモログ単独の発現により、4-メチルアルデヒド中間体が生成されました。 SdmBホモログのみの発現では、脱メチル化中間体は生成されませんでした（補足図8および9）。 興味深いことに、SdmABホモログの共発現ではC-4のメチル基は除去されませんでした（図3b）。これは、これら2つのタンパク質がE.サリナおよびE.サリナのC-4位置でラノステロールを完全に脱メチル化するには十分ではないことを示しています。 E.サリナのSdmABと好気性メタノトローフで見られるホモログを区別します。

a 大腸菌異種発現系におけるラノステロール (I) 基質生成を示すトータルイオンクロマトグラム。 b E.サリナからのSdmABホモログの共発現により、4-メチルアルデヒド中間体(III)のみが生成される。 これら 2 つの酵素は C-4 での脱メチル化には不十分であり、好気性メタノトローフ生物の SdmAB ホモログとは区別されます。 c E.サリナからのSdmAC相同体の共発現により、C-4の単一メチル基が除去される。 d E. salina からの SdmABC ホモログの共発現により、C-4 での完全な脱メチル化が生じます。 脂質はトリメチルシリル基に誘導体化されました。 C-4 脱メチル化中間体は以前の研究で確認されており、公開されている質量スペクトルとの比較によってここで特定されました (32)。 同定されたステロールの質量スペクトルを補足図9に示します。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

次に、E.サリナホモログによるC-4脱メチル化の欠如がSdmAまたはSdmBに関係しているかどうかを決定しようとしました。 これを行うために、我々は、発現系で単一のメチル基を除去する Meticococcus capsulatus の SdmA および SdmB ホモログを利用し、E. salina の相互の SdmA または SdmB パートナーを使用して発現させました。 E. salina からの SdmA と M. capsulatus からの SdmB の発現では C-4 で単一のメチル基が除去されましたが、E. salina からの SdmB と M. capsulatus からの SdmA の発現では C-4 での脱メチル化は起こりませんでした（補足）図10）。 したがって、我々は、E.サリナSdmAホモログは脱メチル化に必要な酸素化反応を実行できるが、E.サリナSdmBホモログはC-4位での脱メチル化に必要な脱炭酸反応と還元反応の両方を実行するには不十分であると提案します31。 これらの結果により、脱炭酸反応と還元反応を実行する可能性のある酵素について E. サリナを再評価することができました。

E.サリナゲノムの追加のBLASTp検索を通じて、Myxococcota亜目ナンノシスタ科に限定される、SdmB、SdmC（1×e-120、51％同一性）に相同な別のSDR型レダクターゼを同定しました（補足図11）。 SdmC単独の発現では、脱メチル化中間体の蓄積は生じませんでした（補足図8）。 しかし、E.サリナからSdmCとSdmAを共発現させると、C-4の単一メチル基が除去される結果となり、SdmCが酸化メチル基を脱炭酸し、C-3に残っているケトンをヒドロキシルに還元できることが示唆された。 M. capsulatus SdmB について示されています (図 3c)31。 さらに、SdmCとE.サリナSdmABの共発現により、C-4の両方のメチル基が除去され、追加の脱メチル化中間体が生成されます（図3d）。 したがって、E.サリナのC-4位置での完全な脱メチル化は、好気性メタノトローフ生物および真核生物の両方の細菌のC-4脱メチル化とは異なります（補足図12）。

SdmC は特定の粘液細菌亜目に限定されているように見えますが、SdmAB 相同体はドメイン全体のさまざまな分離株およびメタゲノム獲得ゲノム (MAG) で見つかります。 これには、5 つの異なる門にわたる 31 個の細菌が含まれます (補足データ 1)。 我々は、これらの他の SdmAB ホモログもラノステロールを二重に脱メチル化するのに十分であるか、あるいはそれらが好気性メタノトローフにおいて SdmAB ホモログとより類似して機能し、C-4 の単一のメチル基のみを除去するかどうかを判断することに興味がありました。 特に、シアノバクテリアＣａｌｏｔｈｒｉｘ ｓｐ． NIES-4105ゲノムには、21 kbの遺伝子クラスターにSdmABホモログが含まれており、オキシドスクアレン生成、環化、C-14脱メチル化、C-8異性化、およびステロール生合成に関与すると考えられるいくつかの追加タンパク質のホモログも含まれています（図4aおよび補足表2） ）。 シアノバクテリアにおけるステロール生合成遺伝子のこの多様性はこれまで観察されておらず、このことは、この Calothrix 株が C-4 位で完全に脱メチル化された複合ステロールを生成する可能性があることを示唆しています。 これをテストするために、我々はまず、オキシドスクアレン産生大腸菌株でCalothrix oscホモログを異種発現させ、その結果ラノステロールが生成され、Calothrixシクラーゼが機能していることを確認しました（補足図13）。 次に、Calothrix SdmAB ホモログを発現させて、これらのタンパク質が C-4 で脱メチル化できるかどうかを確認しました。 SdmAホモログのみの発現は4-メチルアルデヒド中間体の生成をもたらし、一方、SdmBホモログのみの発現はラノステロンの生成をもたらした（補足図8および9）。 Calothrix SdmABの共発現は、C-4の両方のメチル基を除去するのに十分であり、E.サリナ、好気性メタノトローフ生物、および真核生物とは異なる、3番目の細菌C-4脱メチル化経路を示しました（図4bおよび補足図12）。

a Calothrix のステロール生合成遺伝子は、単一の遺伝子クラスターに局在しています。 BLAST 検索によって特定された遺伝子は赤色で示され、テキスト ラベルは太字で表示されます。 注目すべきは、コレステロール生合成における追加のステップの実行に関与している可能性がある、推定上の生合成遺伝子として注釈が付けられている他のいくつかの遺伝子である。 b 異種発現系におけるラノステロール基質生成と、C-4 での完全な脱メチル化をもたらす Calothrix からの SdmAB ホモログの共発現のトータル イオン クロマトグラム。 脂質はトリメチルシリル基に誘導体化されました。 C-4 脱メチル化中間体は以前の研究で確認されており、公開されている質量スペクトルとの比較によってここで特定されました (32)。 同定されたステロールの質量スペクトルを補足図9に示します。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

Calothrix における複合ステロール生成の遺伝的および生化学的証拠を考慮して、次にこの細菌によって生成されるステロールを分析しました。 私たちの最初の分析では、細胞バイオマスを酸加水分解した後にのみステロールを検出できました（補足図1、2、および13）。 これらのステロールには、コレステロールのほか、C-24 不飽和中間体と C-24 飽和中間体の両方が含まれます。 また、加水分解された Calothrix 抽出物中の 25-OHC も同定され、ステロールが Calothrix で結合している可能性があることがさらに示唆されました。 しかし、脂質分析の過程を通じて、Calothrix はすべてのステロール生成を停止しました。 Calothrix におけるステロール生産の損失がステロール生合成遺伝子クラスターの遺伝子変異によるものであるかどうかを判断するために、我々は連続継代株のゲノムを配列決定し、それを Calothrix sp. の参照ゲノムと比較しました。 NIES-4105。 JGI IMGおよびNCBIデータベースで利用可能な参照ゲノムと比較して、連続継代株のゲノムで14の変異を検出しましたが、これらの変異はいずれもステロール生合成遺伝子クラスター内またはその上流で発生しませんでした（補足表3）。 これらの結果は、Calothrix の最初のステロール分析は決定的ではありませんが、我々の発見は、シアノバクテリアが生合成の複雑なステロールの潜在的な供給源であり、細菌のステロール生合成を調査する際にさらに考慮すべき門であることを示唆しています。

この研究では、細菌が新たにコレステロールを合成する能力を持っていることを実証し、しばしば真核生物に関連する生合成の複雑さを示し、細菌におけるステロールの微妙な生理学的機能の可能性を示唆しています。 E.サリナの分析により、コレステロールとコレステロール生合成経路の中間体が同定されました。 これらの脂質を定量すると、生合成中間体がコレステロール自体と同等またはそれ以上の濃度で発生することがわかります。 これは、多くの真核生物におけるコレステロール生成とは異なります。真核生物では、中間体は存在する可能性がありますが、多くの場合、コレステロールや他の「最終生成物」ステロールよりも濃度が桁違いに低くなります 34,35。 この細菌におけるこれらの中間体の濃度がコレステロールと比較して高いことを考慮すると、デスモステロールやザイモステロールなどのコレステロール中間体は、それ自体が機能性脂質として機能すると考えられますが、それらの機能が何であるか、またそれらがコレステロールと異なるかどうかは不明のままです。

Calothrix の我々の分析により、複合ステロール生産能力のゲノム的および生化学的証拠が提供されましたが、この細菌によるステロール生産は依然として不確実です。 歴史的に、シアノバクテリアにおける新たなステロール生合成は物議を醸してきた。 シアノバクテリアの初期のステロール分析は、複合ステロール生合成の能力を示唆しました 36。 しかし、ゲノムを裏付ける証拠は不足しており、いくつかのケースでは、ステロール生成が真菌汚染によって引き起こされることが後に証明されました 37,38。 Calothrix 由来のステロール生合成タンパク質の機能を実証した我々の研究は、他のシアノバクテリアでも同様の遺伝的能力を示すバイオインフォマティクス データと組み合わせることで、これらの細菌に見られる生合成酵素の今後の研究と、それらが生成するステロールのさらなる分析を奨励します。 さらに、他の粘液菌やシアノバクテリア、放線菌、酸性菌、ニトロスピレア菌などの多様な細菌において、C-14 および C-4 脱メチル化を含む複雑なステロール生合成に必要な遺伝子を同定しました (補足データ 1)。 これらの細菌の多くでは、ステロール生成はまだ分析されていません。 より堅牢な脂質分析と細菌のステロール生合成のさらなる研究を組み合わせることで、細菌内のステロールの分布、多様性、複雑さをよりよく把握できるようになります。

E.サリナにおける遊離ステロールと共役ステロールの存在は、細菌ステロール生産の生合成の複雑さの別の例を提供します。 細菌のステロール結合は大腸菌サリナに限定されません。 他の細菌は、新たな生合成の生成物 21 または外因的に獲得したステロールの修飾のいずれかとしてステロールを結合します 39,40。 これらの異なるステロールプールは、細菌におけるステロールのさまざまな生理学的役割の可能性を示唆しています。 他の高分子との結合はステロールの生物物理学的特性に影響を与え 41、真核生物系では、これらの修飾脂質は脂質貯蔵や細胞防御などの特定の機能に関与しています 16,17。 ステロール生成細菌では完全なステロール結合体は同定されていないが、外因性ステロールを修飾できる真核生物および細菌で同定されたステロール結合体は、これらのステロール生成細菌に存在する可能性のある分子の種類についての洞察を提供する可能性がある。 これには、真核生物 35 とステロール修飾細菌 39 の両方で同定されているステリル グルコシドと、我々の知る限りでは真核生物でのみ発見されているステロール エステルが含まれます 16,42,43。 ステロール脂質の分析に使用される抽出技術を拡張し、存在するステロール抱合体を同定し、下流の修飾に関与する酵素を探索することにより、細菌ドメインにおける抱合ステロールの多様性をより適切に評価できると同時に、ステロールの機能をさらに探索するための基盤が提供されるでしょう。

細菌によるコレステロール生成は、細菌ドメインにおけるステロール生合成の複雑な進化の歴史も示しています。 複雑なステロール生合成は古くからあるプロセスです。 ステロール環化に関与するオキシドスクアレン シクラーゼ (OSC) は、大酸化現象を中心に進化したと考えられており 32、現代の真核生物のステロール生合成遺伝子は、真核生物の最後の共通祖先よりも古いと考えられます 5。 細菌におけるステロール生合成は、真核生物からの水平遺伝子伝達の産物であると理論づけられており、その希少性と細菌門全体にわたる不均一な分布によって裏付けられています32。 しかし、OSC および C-14 デメチラーゼ (CYP51) の最近の系統解析および構造解析では、これらのタンパク質の起源が細菌であることが示唆されています 25、26、44。 私たちが特定した推定上のE.サリナコレステロール生合成経路は、真核生物の経路とほぼ相同であり、この粘液細菌と真核生物の間のコレステロール生合成の多くについて共通の進化史を示しているが、私たちの分析は獲得の方向性についての洞察を提供していない。 しかし、我々は不飽和修飾に関与するいくつかのコレステロール生合成タンパク質を同定しましたが、これらのタンパク質は系統解析では考慮されていませんでした（補足データ1）。 これらの下流タンパク質をさらに生化学的および系統学的に分析すると、これら 2 つのドメインにおけるステロール生成を支配する進化的関係がよりよく解明される可能性があります。

細菌の C-4 脱メチル化は、ステロール生合成における独立した進化の明確な例を提供し続けています。 私たちは、真核生物、好気性メタノトローフ生物、および相互のタンパク質とは異なる、E. サリナおよびカロトリクスにおける完全な C-4 脱メチル化に関与するタンパク質を同定しました。 真核生物における C-4 脱メチル化は、C-4 ステロール メチル オキシダーゼ (ERG25/SMO)、C-4 デカルボキシラーゼ (ERG26/3β-HSD/D)、および 3-ケトステロイドの 3 つのタンパク質によって実行される酸素依存性反応です。レダクターゼ (ERG27/3-SR)45,46,47。 3 つのタンパク質はすべて、C-4 位の両方のメチル基を連続的に除去する反復プロセスに関与していますが、植物は 2 つの異なる SMO タンパク質を利用して各メチル基を非連続的に除去することが示されています 48。 我々は、好気性メタノトローフ生物において、C-4 脱メチル化により 1 つのメチル基が除去され、リースケ型オキシゲナーゼ SdmA および NADP 依存性レダクターゼ SdmB31 によって行われることを以前に示しました。 E. salina と Calothrix は両方とも SdmA と SdmB の相同体を保有していましたが、これら 2 つのタンパク質が C-4 位の両方のメチル基を除去するのに十分であるかどうかは不明でした。 我々は、2つのCalothrix相同体がC-4の両方のメチル基を除去するのに確かに十分であるが、E.サリナが完全に脱メチル化するには2番目のレダクターゼを必要とすることを示す。 これらの酵素は標準的な真核生物のタンパク質とは非相同であり、これらの細菌におけるコレステロール生合成が単純な遺伝子水平伝達の例ではないことを証明しています。 むしろ、これは、生命の両方の領域におけるステロール機能における C-4 ステロール脱メチル化の重要な役割を示唆する、ステロール生物学における収束進化の事例を表しています。 実際、C-4 脱メチル化酵素の変異は致死的なことが多いため、真核生物の適切な機能には C-4 脱メチル化が必要であることが示されています 45,49,50。 不明な点は、細菌細胞においてC-4脱メチル化がどのような機能的役割を果たしているのか、そして真核生物で観察されるような適切なステロール機能にC-4脱メチル化が必要であるのかどうかである。 さまざまな細菌の C-4 脱メチル化経路のさらなる生化学的および構造的特徴付けにより、この修飾の機能的重要性についての比較洞察が得られるはずです。

最後に、細菌における複雑なステロール生合成も、その潜在的な産業および生物医学的応用にとって興味深いものである。 細菌のホパノイドや真菌のステロールを含む環状トリテルペノイド脂質の生成は、温度やエタノールストレスなどの工業培養条件下で遭遇するさまざまなストレスに対するこれらの微生物の回復力を高めることが示唆されています51,52。 ステロール生合成遺伝子の理解とステロール発現系の開発は、産業用途向けに微生物をより適切に操作するさらなる機会を提供します。 さらに、E.サリナの他の分離株を含むいくつかの粘液細菌は、実証された抗菌特性を持つステロイド由来の二次代謝産物を生成します53、54、55。 しかし、粘液細菌、特に大腸菌サリナのような海洋環境由来の粘液細菌は、多くの場合培養が難しく、遺伝的に扱いにくく、低濃度で二次代謝産物を生成します56。 これにより、これらの生物における天然産物の生合成経路の理解と、これらの化合物を生成する異種システムの開発への関心が高まっています57。 粘液細菌におけるステロイド生合成の探査により、新規生合成酵素がさらに明らかになり、これらの化合物をより適切に生産するための枠組みが提供される可能性があります。 さらに、C-4 脱メチル化を探索するためにここで使用するモジュール式異種発現システムは、コレステロール生合成における生合成中間体を過剰生産する機会を提供しますが、そうでなければその多くは商業的に入手できないか、法外に高価です。 これらの生合成中間体は、真核生物におけるコレステロール生合成、調節、機能の研究に有用であることが証明されており、場合によっては臨床的意義を持っています58。 これらの異種システムを使用して細菌のコレステロール生合成の特徴付けを続けることで、他の生物のステロールをよりよく研究するためのツールがさらに構築されるとともに、ステロールの生物学と進化に関するより広範な疑問への洞察も得られるでしょう。

この研究で使用した菌株は、SI 付録の表 S4 にリストされています。 E. サリナ DSM 15201 を、オートクレーブして濃縮した全細胞大腸菌を補充した三角フラスコ内の海水塩 (SWS) 培地 (pH 7) 20 ml で、225 rpm で振盪しながら 30 °C で培養しました (Thermo Scientific、MaxQ8000) ）、14日間27． 濃縮全細胞大腸菌を調製するために、大腸菌DH10Bを三角フラスコ中の500mlのLB培地中でOD600が1.0〜1.5になるまで増殖させた。 この大腸菌をペレット化し、50mlのSWSに再懸濁し、オートクレーブ処理した。 14 日間にわたって、培地が透明になるにつれて、この濃縮大腸菌懸濁液 5 ml を大腸菌培養液に供給しました 59。 カロトリックス sp. NEIS-4105 を三角フラスコ中、20 ml の BG-11 液体培地、pH 760 中で 25 ℃、10 時間の明期、14 時間の暗期サイクルで 60 日間培養しました。 大腸菌異種発現株を、225 rpmで振盪しながら30℃または37℃の25mlのTYGPN培地で培養し、必要に応じてゲンタマイシン（15μg/mL）、カナマイシン（30μg/mL）、カルベニシリン (100 μg/mL)、および/またはクロラムフェニコール (20 μg/mL)。

結合していないステロールは、修正されたブライダイアー抽出によって凍結乾燥細胞ペレットから抽出されました28。 ペレットを１０：５：４（体積：体積：体積）メタノール：ジクロロメタン（ＤＣＭ）：水中で１時間超音波処理した。 次いで、２倍量の１：１（体積：体積）ＤＣＭ：水を使用して脂質を相分離した。 有機相を移し、N2ガス下で蒸発させて、全脂質抽出物(TLE)を得た。 該当する場合、TLE は、次のカラム スキームによる Si クロマトグラフィーを使用して極性によって分画されました: 1.5 カラム容積のヘキサン、2 カラム容積の 8:2 (容積:容積) ヘキサン: DCM、2 カラム容積の DCM、2 カラム容積 1: 1 (体積:体積) DCM: 酢酸エチル、2 カラム容量の酢酸エチル。それぞれアルキン、非極性、ケトン、アルコール、極性画分が得られます61。

結合ステロールは、脂質抽出物、Si-ゲルクロマトグラフィー画分、または凍結乾燥した細胞ペレットをメタノール中の1 N HClまたはKOHで加水分解し、75℃で3時間加熱することによって分析しました。 反応物をそれぞれKOHまたはHClを使用して中和し、2倍量の1:1(容積:容積)DCM:水を使用して相を分離した。 有機相を移し、N2ガス下で蒸発させた。 該当する場合、ブチル化ヒドロキシトルエン (BHT) を、BHT: MeOH62 の最終濃度 0.01% (wt:vol) で酸加水分解サンプルに添加しました。

サンプル中のコレステロール、デスモステロール、ザイモステロール、および 25-ヒドロキシコレステロール (25OCH) 濃度は、10 ng ～ 100 ng の範囲の標準曲線を使用して定量されました。 ステロール含量は標準曲線を使用して計算され、各サンプルの乾燥細胞重量に対して正規化されました。 さらに、当社の質量分析計でのステロールの検出限界は、ステロール標準混合物を希釈することにより 1 ～ 5 ng であることが判明しました。

すべての脂質は、1:1 (体積:体積) ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド:ピリジンを使用してトリメチルシリルエーテルに誘導体化し、70 °C で 1 時間加熱してから、Agilent 7890B シリーズ GC で分析しました。 脂質は、60 m Agilent DB17HT カラム (60 m x 内径 0.25 mm x 膜厚 0.1 μm) でヘリウムをキャリアガスとして 1.1 mL/min の一定流量で使用し、次のようにプログラムして分離しました。 次に 8 °C/min で 250 °C まで昇温し、10 分間保持します。 次に 3 °C/min で 330 °C まで昇温し、17 分間保持します。 合計 2 μL の各サンプルを 250 °C でスプリットレス モードで注入しました。 GC は 230 °C のイオン源を備えた 5977 A シリーズ MSD に接続され、EI モードで 70 eV で動作し、0.5 秒で 50 ～ 850 Da をスキャンしました。 脂質は、Agilent MassHunter 定性分析 (B.06.00) を使用して分析され、以前に確認された実験室標準、公開されたスペクトル 31、63、64、および米国油化学会 (AOCS) に寄託されたスペクトルと比較することにより、保持時間とスペクトルに基づいて同定されました。ライブラリ (http://lipidlibrary.aocs.org/index.cfm) または米国標準技術研究所 (NIST) データベース。

この研究で使用したプラスミドおよびオリゴヌクレオチドを補足表 5 および補足表 6 に記載します。オリゴヌクレオチドは Integrated DNA Technologies (アイオワ州コーラルビル) から購入しました。 GeneJET ゲノム DNA 精製キット (Thermo Scientific) を使用して、E. サリナからのゲノム DNA を単離しました。 Calothrix sp. からのゲノム DNA NEIS-4105 はフェノール-クロロホルム抽出 65 を使用して単離され、25:24:1 フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (体積:体積:体積) の 1 倍量をバイオマスに添加し、遠心分離し、水層を除去しました。 これを 2 回繰り返した後、2 倍量の 70% エタノールを使用してゲノム DNA を沈殿させました。 プラスミド DNA は、GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific) を使用して単離されました。 クローニング中に使用された DNA フラグメントは、GeneJET ゲル抽出キット (Thermo Scientific) を使用して単離されました。 DNA は ELIM Biopharm (カリフォルニア州ヘイワード) によって配列決定されました。

プラスミドは、配列およびライゲーションに依存しないクローニング (SLIC)66 によって構築されました。 簡単に説明すると、ヌクレオチドの非存在下で T4 DNA ポリメラーゼ (EMD Milipore) とインキュベートすることにより、ゲル精製 PCR 産物インサートおよび制限酵素直線化ベクター上に相補的なオーバーハングを作成しました。 続いて、ライゲーションを行わずにアニーリング反応と形質転換を行いました。 製造業者の推奨に従って、MicroPulser Electroporator (BioRad) を使用したエレクトロポレーションによって大腸菌株を形質転換しました。

ステロール生合成遺伝子は、IPTG 誘導性 lac またはアラビノース誘導性 araBAD プロモーターのいずれかと互換性のあるプラスミドから大腸菌で過剰発現されました 33。 異種発現株を補足表7に記載のように構築した。目的の遺伝子をIPTG誘導性プラスミドpSRKGm-lacUV5-rbs5および/またはアラビノース誘導性プラスミドpBAD1031Kから発現させた。 大腸菌株を、500 μM IPTG および 0.2% (wt:vol) アラビノースで発現が誘導される指数関数期中期まで、抗生物質 (必要に応じて) を補充した 20 mL TYGPN 培地で 37 °C で培養しました。細胞を採取する前に、225 rpm で振盪しながら 30 °C で静置します。

E. salina および Calothrix のステロール生合成遺伝子を同定するために、BLASTp 検索を実施しました 67。 推定ステロール生合成遺伝子とみなされるために、e 値カットオフ 1 xe-30 とパーセント同一性カットオフ 30 を設定しました。BLASTp 検索結果は補足表 2 にリストされています。ステロール生合成遺伝子を保有する他の細菌を同定するにはE. salina と Calothrix で同定した後、まず、OSC (<1 × e −50、 30%ID）。 この細菌のサブセットについて、E. salina および Calothrix から同定されたタンパク質を使用して、さらに BLASTp 検索 (<1 × e-50、30%ID) を実施しました 68,69。 SdmBC ホモログの隣接結合ツリーは、MEGA (11.0.10) の MUSCLE を使用してタンパク質配列を整列させることによって生成されました。 次に、ガンマ モデル、4 つのガンマ レート カテゴリ、および 500 回のブートストラップ反復を使用して系統樹を生成しました。

ライブラリーの調製 (Illumina DNA Prep Kit; San Diego, CA) および全ゲノム配列決定は SeqCenter (SeqCenter; Pittsburgh, PA) によって実行され、Illumina NextSeq 2000 で配列決定され、2x151 bp のリードが生成されました。 Bclconvert (v3.9.3) は、逆多重化、品質管理、トリミングに使用されました。 連続継代株の変異を特定するために、breseq (v0.35.4)70 を使用してバリアントコールを実行しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究で生成されたデータは、補足情報ファイルとソース データ ファイルで提供されます。 E. salina および Calothrix のステロール生合成遺伝子の JGI IMG (https://img.jgi.doe.gov/) 遺伝子 ID は補足表 2 に示されています。ソース データ ファイルには、生成に使用される生のトータル イオン クロマトグラム データが含まれています。本文と補足図、および補足スペクトルデータの生成に使用される生の質量分析データ。 ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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有益な議論をしてくれた Welander ラボのメンバーに感謝します。 この研究の資金は、米国科学財団賞 1919153 (PVW へ) によって提供されました。

スタンフォード大学地球システム科学部、スタンフォード、カリフォルニア、94305、米国

アリーシャ・K・リー、ジェレミー・H・ウェイ、ポーラ・V・ウェランダー

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AKL、JHW、および PVW が研究を設計しました。 AKL と JHW は調査を実施しました。 AKL、JHW、および PVW が分析したデータ。 AKL、JHW、PVW がこの論文を執筆しました。

ポーラ・V・ウェランダーへの往復書簡。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた Miguel C. Santoscoy と他の匿名の査読者に感謝します。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Lee, AK、Wei, JH & Welander, PV 細菌における新たなコレステロール生合成。 Nat Commun 14、2904 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38638-8

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受信日: 2022 年 10 月 20 日

受理日: 2023 年 5 月 5 日

公開日: 2023 年 5 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38638-8

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