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May 18, 2023

セルの 1 対 1 の比較

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 6394 (2023) この記事を引用

521 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

食品医薬品局 (FDA) が承認したポリ (エチレングリコール) (PEG) 修飾薬が 20 種類以上市販されており、PEG はバイオコンジュゲーションにおけるゴールドスタンダードのポリマーです。 カップリングにより安定性と効率が向上し、治療用タンパク質の血液循環時間を延長できます。 PEG化は非毒性かつ非免疫原性であると説明されていますが、PEGに対するアレルギー反応を示すデータが報告されています。 PEGは治療薬だけでなく食品や化粧品にも含まれているため、治療を受けていなくても抗PEG抗体が発生する可能性があります。 したがって、PEGに対する過敏症は、薬物効率の低下、急速な血中クリアランス、およびまれにアナフィラキシー反応を引き起こす可能性があります。 したがって、PEG の代替品を見つけることが重要です。 この研究では、PEG の代替ポリマーとしてバイオコンジュゲーション用の直鎖ポリグリセロール (LPG) を紹介します。 我々は、真核生物の無細胞タンパク質合成系で合成された糖タンパク質エリスロポエチン（EPO）へのクリックケミストリーによるLPGとPEGの結合について報告する。 さらに、成長ホルモン依存性細胞株における EPO の安定性と活性に対するポリマーの影響を評価しました。 両方のバイオコンジュゲートの同様の特性は、LPG 化が PEG 化の有望な代替手段となり得ることを示しています。

EPOは、新しい赤血球の生成を調節するホルモンとして知られています。 最近の出版物のほとんどは、赤血球増加症 1、虚血性脳卒中 2、貧血 3、低酸素症 4、腫瘍血管新生 5、および神経変性疾患 6 に対する EPO の作用機序に関する新しい発見を扱っています。 遺伝子組み換えされた EPO 変異体は特​​に注目を集めています。 エリスロポエチン刺激薬 (ESA) は、エリスロポエチン アルファおよびベータから始まり、ダルベポエチン アルファ 7 やペグ化 EPO (PEG-EPO8) などのより長い半減期をもつ変異体まで継続的に改良されました。 PEG-EPO は、投与間隔を長くすると赤血球生成をより効果的に刺激することが知られています9。 PEG 化 EPO (Mircera®) は 2007 年に食品医薬品局 (FDA) の承認を取得し、腎臓病に伴う貧血に対して処方されています 10,11。 PEG化EPOおよび他のバイオ医薬品の成功に基づいて、PEG化医薬品の世界市場は2024年に105億米ドルに達すると予想されています12。それにもかかわらず、PEG化バイオ医薬品には本質的な問題、つまりPEGに対する抗体が発生します。 PEG は、FDA が承認した 20 以上のタンパク質ベースの医薬品に結合される、非毒性および非免疫原性の生体適合性ポリマーとみなされています 13。 さらに、mRNA ワクチンなどの非タンパク質治療薬には、PEG 化ナノ粒子が含まれています 14。 PEG 修飾されたタンパク質、酵素、ペプチド、およびナノ粒子は、水溶性とタンパク質分解の安定性が向上し、半減期が延長されるという特徴があります 15。 大幅な進歩が見られるものの、PEG化システムには依然として一定の制限があり、その広範な使用が制限される可能性があります。 これらの制限には、PEG化物質を繰り返し使用した後の抗PEG抗体の生成による治療効果の低下、および特定のケースではアナフィラキシーのような重篤なアレルギー反応が含まれます16。 Yangらの研究。 は、定量的競合酵素免疫吸着法を使用して、現代のサンプルの 72% から抗 PEG 抗体を同定しました 17。 興味深いことに、彼らは、1970 年代から 1990 年代の血清サンプルの 50% が実際に抗 PEG 抗体も保有していることを認識しました。 新しく、より感度の高いアッセイにより、抗 PEG 抗体および関連する免疫原性反応の検出がより頻繁に行われます。 さらに、PEG を含む化粧品、石鹸、医薬品などの日用品の使用も、既存の抗 PEG 抗体の存在に影響を与える可能性があります 18,19。 したがって、抗PEG抗体の信頼できる検出とPEG化分子による治療の正確な適応から始めて、PEG化薬物の取り扱いを再考することが不可欠です。 さらに、半減期延長のために PEG に代わる多くの天然および合成ポリマーが研究されています 20、21、22、23。 これに関連して、直鎖状ポリグリセロール (LPG) は、PEG24 と構造と特性が類似しているため、有望な候補となります。 LPG と PEG は両方ともポリエーテル骨格を持っていますが、LPG は各繰り返し単位にヒドロキシル基を持っているため、固定化、ターゲティング、および標識部分の導入が可能です 25,26。 LPG は生体適合性が高く、最大 10 個の繰り返し単位を持つオリゴグリセロールのエステルは FDA によって医薬品および食品添加物として承認されており、数十年にわたって市販されています 27,28。 LPG は最近、ウシ血清アルブミンへのランダム結合 29、エクセナチドへの銅(I) 触媒によるアジドアルキン付加環化 (CuAAC) による部位特異的結合、インターロイキン 30 への N 末端結合など、さまざまな結合化学を介してさまざまなモデルタンパク質への結合に成功しています。アナキンラ 31 とインターフェロン α-2a32、33 への株促進アジド アルキン付加環化 (SPAAC) を介した部位特異的結合。

分子量の異なる PEG と EPO のカップリングは過去 20 年間で盛んに評価されてきましたが、代替ポリマーの使用を実証した報告はわずかです。 さらに、ペプチド鎖はグリコシル化部位の欠失をもたらす修飾を受けることが多く、結合化学は N 末端または C 末端のいずれかに限定されていました 34。 たとえば、エリスロポエチン模倣ペプチドは生分解性ヒドロキシエチルデンプンに結合され、生物学的効果を強化しました 35。 多くの場合、これらのカップリングは過酷な条件での化学プロセスに基づいています。 私たちの研究では、温和な条件下で双直交クリック反応によって、3 つの N-グリコシル化部位すべてが損なわれていない EPO に結合したさまざまなポリマーの比較を初めて示します。 さらに、無細胞タンパク質合成を使用すると、さまざまな EPO コンジュゲートが非常に短時間で合成され、さまざまな構築物の並行分析が可能になりました。 したがって、我々は部位特異的なPEG化EPOとLPG化EPOの両方を合成し、成長ホルモン依存性細胞株TF-1に対するEPOの活性に対するそれらの影響を調査しました。 内因性 hEPO 受容体が存在するため、我々は TF-1 細胞株を選択しました。 この細胞株は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)、さまざまなインターロイキン、EPO などの活性造血増殖因子の存在下で増殖することが知られています。 私たちは、これらの LPG および PEG バイオコンジュゲートを市販の Mircera® と比較し、ヒト血清中の個々の EPO の安定性を分析しました。 この目的のために、以前に報告されているように、EPO は無細胞系で合成されました 36。 翻訳活性のあるライセートには、内因性 ER 由来の膜小胞、いわゆるミクロソームが含まれており、これにより内腔への移行とその後のグリコシル化やジスルフィド架橋などの翻訳後修飾が可能になります 37。どちらも EPO の活性にとって不可欠な前提条件です。 無細胞系では O-グリコシル化は不可能であるため、PEG ポリマーと LPG ポリマーのカップリングにはこの位置が選択されました。 したがって、アンバー終止コドンが遺伝子配列に導入されました。 適切なサプレッサー tRNA と人工アミノアシル tRNA シンテターゼを無細胞反応に添加すると、p-アジド-1-フェニルアラニン (AzF) が新生ポリペプチド鎖に組み込まれました 36。 アジド基はさらに、SPAAC を介してシクロオクチン修飾 PEG および LPG をクリックするために利用され、その結果、部位特異的に修飾された EPO が得られました。 私たちの研究は、LPG化EPOコンジュゲートが細胞培養においてPEG化対応物と同等の活性を示し、24時間以上安定であることを示しています。

無水溶媒 (ジメチルホルムアミドおよびトルエン)、ベンゾイル化セルロース透析チューブ (2 kDa、幅 32 mm) は、Merck (ダルムシュタット、ドイツ) から購入しました。 臭化テトラ-n-オクチルアンモニウム 98% は ACROS Organics から購入し、受け取ったまま使用しました。 他のすべての化学物質は、特に明記されていない限り、Merck (ダルムシュタット、ドイツ) から購入しました。 10 kDa α-メトキシ-ω-アミノ-ポリ (エチレングリコール) (PEG-NH2) (Rapp POLYMERE、ドイツ、テュービンゲン) をそのまま使用しました。 １Ｈ ＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＡＭＸ ５００（Ｂｒｕｋｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）またはＪＥＯＬ ＥＣＰ ５００（ＪＥＯＬ ＧｍｂＨ）で記録した。 化学シフト (δ) は、標準として重水素化溶媒のピークを介して ppm で報告されます。 IR 測定は、検出器範囲 4000 ～ 650/cm の Nicolet AVATAR 320 FT_IR 5 SXC (Thermo Fisher Scientific) で行われました。 水中でのゲル浸透クロマトグラフィー (GPC) 測定は、自動インジェクター、アイソポンプ、および Agilent 1100 示差屈折計を備えた Agilent 1100 (Agilent Technologies、サンタクララ、カリフォルニア州、米国) を使用して実行されました。 PSS Suprema (プレカラム)、1 × 細孔径 30 Å、2 × 細孔径 1000 Å (すべて粒径 10 μm) カラムは、測定前にプルラン標準に対して校正されました。 テトラヒドロフラン (THF) での GPC 測定は、自動インジェクター、アイソポンプ、UV および RI 検出器を備えた Agilent SECurity (1200 シリーズ) を使用して行われました。 分離は、ポリスチレン標準に対して校正された、Agilent のフォトルミネッセンス ゲル (プレカラム 1 個、粒径 5 μm の Mixed-C 3 個) を介して行われました。

グリシドールのアセタール保護、その重合、および鎖末端修飾は、米国から以前に報告された手順に基づいて実行されました32。 要約すると、火炎乾燥したシュレンクフラスコ中で、(Oct)4NBr (268 mg、0.480 mmol、0.008 当量) をアルゴン雰囲気下で乾燥させた。 その後、これを室温で６０ｍＬの乾燥トルエンに溶解し、その後、エトキシエチルグリ​​シジルエーテル（ＥＥＧＥ）（１０ｍＬ、６５．６ｍｍｏｌ、１当量）を添加した。 混合物を氷浴で冷却し、高速撹拌下でi-Bu3Al(2.1mL、2.4mmol、0.036当量)を加えた。 反応を室温で一晩進行させ、１ｍＬのエタノールを加えて反応を停止させた。 粗生成物をアセトンに対する透析により精製した（ＭＷＣＯ：２０００ｇ／モル）。 生成物を淡黄色の油として得た（ＴＨＦ中のＧＰＣ：Ｍｎ：２０６８７、ΔＩ：１．１２）。 アセタール基を除去するために、ポリマーをエタノール（０．１ｇ／ｍＬ）およびＨＣｌ（３％ｖ／ｖエタノール）に少なくとも２時間溶解させた後、水中で透析した（ＭＷＣＯ：１０００ｇ／ｍｏｌ）。 生成物を無色の油状物として得た（ＧＰＣ水：Ｍｎ：１１８８５、ΔＩ：１．１９）。 その後、脱保護されたポリマー (1 g、0.08 mmol、1 当量) を 5 mL の乾燥 DMF に溶解し、還流下で 80 °C に加熱した後、混合物に NaN3 (30 mg、0.4 mmol、5 当量) を添加しました。 反応をこの温度で３日間進行させ、水中での透析により精製した（ＭＷＣＯ：１０００ｇ／モル）。 修飾の成功は、IR 分光法 (アジド ピークの 2100/cm) によって観察されました。 ＬＰＧ－Ｎ３（１当量）を水（０．０５ｇ／ｍＬ）に溶解することにより、アジド基をアミンに還元した。 その後、ＴＣＥＰ（Ｎ３基に対して１．５当量）を溶液に添加した。 Ｎ３のそれぞれのバンドが消失するまで、反応をＩＲ分光法によりモニターした。 その後、水中での透析により精製を行った（ＭＷＣＯ：１０００ｇ／ｍｏｌ）。 次いで、ＬＰＧ−ＮＨ ２ （１当量）を乾燥ＤＭＦ（３２ｍｇ／ｍＬ）に溶解し、次いで、Ｅｔ ３ Ｎ（３当量）およびＢＣＮ−ＮＨＳ（１．５当量）を混合物に添加した。 反応物を一晩撹拌し、水に対する透析により精製した(MWCO: 1000 g/mol)。 LPG 変性 BCN は乾燥状態では架橋しやすいため、この段階で完全に変換されると想定されます。 LPG-BCNの品質は、1HNMRスペクトルによって監視されました（補足図1）。 水中での GPC 測定に基づくと、LPG の MW は 11.8 kDa です。

市販のPEG-NH2の修飾は、LPG-NH2について上で説明した手順と同様に行った。 PEG-BCNの品質は、1HNMRスペクトルによってモニタリングされました（補足図2）。 水中での GPC 測定に基づくと、PEG の分子量は 10 kDa です。

エリスロポエチン配列をコードする遺伝子配列 (Uniprot P01588) は、無細胞タンパク質合成とアンバー抑制のために改変されました。 したがって、以前に報告されたように DNA テンプレートが変更されました 38。 さらに、天然シグナル配列はメリチンシグナル配列 (aaattcttagtcaacgttgcccttgtttttatggtcgtatacattttcttacatctatgcggac) によって置き換えられました。 2 番目の構築物は、コドン 153 (O-グリコシル化部位) をアンバー終止コドンに交換することによって設計されました。 配列はデノボ合成（Biocat GmbH、ドイツ）によって製造され、pUC57-1.8 k ベクター骨格に連結されました。

操作されたアミノアシル tRNA シンテターゼ (eAzFRS) およびサプレッサー tRNA は、Zemella et al. に詳細に記載されているように製造されました。 201939。簡単に説明すると、アミノアシル tRNA シンテターゼは「RTS500 ProteoMaster E. coli HY Kit」（Biotechrabbit GmbH、ドイツ）で合成され、Strep-Tag を介して精製され、濃縮され、シンセターゼ保存緩衝液（50 mM HEPES、10 mM KOAc、1 mM MgCl2、4 mM DTT、0.02% NaN3、pH 7.6)。

サプレッサー tRNA のテンプレート DNA は、特定の O-メチル プライマー ペアを用いた PCR 反応とそれに続くランオフ転写を使用して生成されました。 tRNA は、TRIzol 試薬 (ThermoFisher Scientific) を使用したフェノール - クロロホルム抽出によって精製し、イソプロパノールで沈殿させ、超純水に再懸濁しました。 tRNA は PCR サイクラー (Biometra TRIO、Analytik Jena) で折りたたまれ、-80 °C で保存されました。

無細胞タンパク質合成は、培養スポドプテラ・フルギペルダ 21 (Sf21) 細胞に由来する翻訳活性のある溶解物に基づいていました。 ライセートの調製は、以前に記載されているように実行されました40、41。 DNA テンプレート (60 ng/μL) を、20% (v/v) ライセート、100 μM アミノ酸、塩、エネルギー成分、および PolyG (10 μM、バイオマー、ドイツ) から構成される反応混合物に添加しました。 反応の詳細なプロトコールは 38,42 に記載されています。 シンチレーションカウンティングによるタンパク質収量およびSDS-PAGEとその後のオートラジオグラフィーによるタンパク質の完全性をモニタリングするために、均一に放射性標識された14C-ロイシン(fc 30μM、Perkin Elmer、ドイツ)を反応液に添加しました。 14C-ロイシンは統計的に新規合成されたタンパク質に組み込まれます。 非標準アミノ酸を組み込むために、2 mM p-アジド-1-フェニルアラニン、3 μM eAzFRS、および 5 μM サプレッサー tRNA を添加しました。 統合の成功はオートラジオグラフィーによって監視されました。 詳細には、アンバー終止コドンを含むプラスミドを用いた共役転写翻訳反応を、直交合成酵素eAzFRSの存在下および非存在下で行った。 eAzFRS の非存在下での合成反応により、アミノ酸 153 で切断された EPO に対応するバンド パターンが得られます。この切断された EPO は、3 つの N-グリコシル化をすべて保持しています。 eAzFRS の存在下での合成反応により、3 つの N-グリコシル化を伴う全長 EPO に対応するバンド パターンが得られます。 バンドパターンの違い、特にシンテターゼの存在下での EPO の見かけの分子量の変化は、AzF の取り込みを証明します。 さらに、AzF の組み込みは、アジド反応性ホスフィン色素の EPO36 への特異的結合によって以前に示されました。

反応物をアルミホイルで覆い、27℃、500rpmで3時間インキュベートしました。

EPO はミクロソーム小胞の内腔に移行するため、タンパク質を放出する必要がありました。 したがって、ミクロソームを 16,000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離し、ペレットを界面活性剤 n-ドデシル-β-マルトシド (0.2% DDM、Sigma-Aldrich、セントルイス ミズーリ州、米国) を含む PBS に再懸濁しました。 １０００ｒｐｍで４５分間撹拌し、再度遠心分離した。 上清を空のエッペンドルフチューブに移し、PEGポリマーとLPGポリマーのカップリング、安定性分析、細胞培養アッセイに使用しました。

ポリマーを水に溶解し、ストック濃度を 5 ～ 10 mM にしました。 10 ngの無細胞生成EPOを5 mM BCN-PEGおよびBCN-LPGとともにエッペンドルフチューブ内で4℃で一晩インキュベートしました。 ポリマーのカップリングは、オートラジオグラフィーにおける EPO のシフトによって監視されました。

修飾および未修飾 EPO の N-グリコシル化は、PNGase F (NEB、米国) によって切断されました。 アッセイは製造業者のプロトコールに従って実施されました。

無細胞合成 EPO のタンパク質収量は、熱トリクロロ酢酸 (TCA、Carl Roth GmbH、ドイツ) 沈殿とそれに続く液体シンチレーション計数によって測定されました 43。

EPO サンプルを冷アセトン中で沈殿させ、乾燥させ、LDS サンプルバッファー (NuPAGE LDS サンプルバッファー、Thermo Fisher Scientific) に再可溶化しました。 サンプルをプレキャスト SDS-PAGE ゲル (NuPAGE、10% Bis–Tris、Thermo Fisher Scientific) にロードし、180 V で 40 分間分離しました。ゲルを水で洗浄し、シンプリー ブルー セーフ ステイン (Thermo Fisher Scientific) で染色し、洗浄しました。また。 その後、ゲルを70℃で60分間乾燥させた(Unigeldryer 3545D、ドイツ)。 ゲルを蛍光体スクリーンに 48 時間曝露しました。 バンドは、蛍光イメージング (Amersham タイフーン RGB、GE Healthcare) によって視覚化されました。

hEPO 受容体を発現する TF-1 細胞 (ライプニッツ研究所 DSMZ、ドイツ、DSMZ 番号 ACC-334) を 85% RPMI-1640 (PAN Biotech)、13% FCS (Biochrom)、1% ピルビン酸ナトリウム (Biowest) 中で培養しました。 ）、1% ペニシリン - ストレプトマイシン (PAN Biotech) および 5 ng/mL GM-CSF (PeproTech、ドイツ)。 細胞は、CO2 インキュベーター (Binder、ドイツ) 内の T25 および T75 フラスコ内で 37 °C、5% CO2 でインキュベートされました。 細胞密度は 2 ～ 7 × 105 細胞/mL の間に維持されました。 活性アッセイでは、2.0 × 105 細胞を GM-CSF を含まない新鮮な培地に移しました。 各 EPO バリアント (無細胞合成、組換え EPO (Sigma-Aldrich、セントルイス ミズーリ州、米国、#E5546-50 UG)、Mircera® (Roche、バーゼル、スイス、0.3 mL)) および GM-CSF を添加しました。最終濃度は 10 ng/mL です。 等量のテンプレートなし対照（NTC）を陰性対照として添加した。 細胞増殖は、Ｌｕｎａ計数チャンバー（Ｌｏｇｏｓ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）内でトリパンブルー染色によって１週間にわたってモニターされた。 アッセイは 3 回繰り返して実行され、各サンプルに対して 2 回の測定が実行され、各サンプルについて 6 つのアリコートが計数されました。

EPOを上記のように合成し、PEGおよびLPGと結合させた。 修飾および非修飾 EPO をヒト血清 (SeraCon II、HiSS Diagnostics、ドイツ) と最長 24 時間インキュベートしました。 0、2、4、8、および24時間後、アリコートを採取し、直ちに液体窒素で凍結させた。 アリコートをアセトン中で沈殿させ、SDS-PAGEにロードしました。 タンパク質バンドの完全性をオートラジオグラフィーによって分析しました。

以下の無細胞合成 EPO へのカップリングを伴う LPG および PEG の合成および鎖末端修飾の一般的なスキームを図 1 に示します。

以下の無細胞合成 EPO へのカップリングによる LPG および PEG の合成および鎖末端修飾の一般的なスキーム。 EPO 構造は PDB エントリ 1BUY44 から取得されます。

EPO の無細胞タンパク質合成により、4 つの明確なバンドを含む明確なバンド パターンが得られました (図 2A)。 これらのバンドは、EPO の 3 つの N-グリコシル化 (1、2、または 3 部位でグリコシル化) および EPO の非グリコシル化形態に対応します。 EPO の追加の O-グリコシル化は、無細胞タンパク質合成中には対処されません。 したがって、非標準アミノ酸が O-グリコシル化の位置に配置されました。 O-グリコシル化の位置に非標準アミノ酸 p-アジド-1-フェニルアラニン (AzF) を導入しても、EPO のグリコシル化パターンは変化しませんでした (アジド-EPO、レーン 3)。 両方のサンプルの PNGase F グリコ消化により、非グリコシル化 EPO の予想分子量でバンドが低くなりました (レーン 2 および 4)。 無細胞合成中に直交シンテターゼを適用しないと、オートラジオグラフィーでは全長 EPO が視覚化されませんでした (レーン 5)。 さらに、グリコシル化末端生成物が検出されました。 PNGase F とのインキュベーション後、脱グリコシル化された終結産物のみが検出されました (レーン 6)。

エリスロポエチンとLPG-BCNおよびPEG-BCNとの化学選択的カップリング。 (A) さまざまな EPO バリアントのオートラジオグラフィー: レーン 1 および 2 は非標準アミノ酸を含まない全長 EPO、レーン 3 および 4 は p-アジド-L-フェニルアラニンが組み込まれた抑制産物、レーン 5 および 6 はアンバーで終了する終結産物停止コドン。 各変異体を、グリコシダーゼ PNGase F の非存在下 (レーン 1、3、5) および存在下 (レーン 2、4、6) で分析しました。AzF の組み込みが成功すると、非結合性の完全長 EPO で見られるのと同等のバンド パターンが得られました。標準アミノ酸。 eAzFRSの非存在下でのEPO（アンバー終止コドンを含む）の合成により、切断された生成物について予想されるように、分子量が減少したバンドパターンが得られた。 (B) LPG-BCN および PEG-BCN を EPO にカップリングした後のオートラジオグラフィー。 レーン 1 ～ 4 およびレーン 9 は、EPO を含む AzF (レーン 1 ～ 2)、終端 EPO (レーン 3 ～ 4)、および非存在下 (レーン 1 および 3) の完全長 EPO (レーン 9) への LPG-BCN のカップリングを示します。 EPO を含む AzF への LPG-BCN のカップリングの成功は、EPO 対応バンドが約 50 ～ 60 のより高い分子量にシフトしていることでわかります (レーン 1 および 2)。 kDa。 レーン 5 ～ 8 およびレーン 10 は、EPO を含む AzF (レーン 5 ～ 6)、終端 EPO (レーン 7 ～ 8)、および非存在下 (レーン 5 および 7) の完全長 EPO (レーン 10) への PEG-BCN のカップリングを示します。 PNGase F の存在 (レーン 6、8、10)。EPO を含む AzF への PEG-BCN のカップリングの成功は、約 40 ～ 48 での EPO 対応バンドの高分子量へのシフト (レーン 5 および 6) によって見られます。 kDa。 トリミングされていないオートラジオグラフィー画像は補足情報に含まれています。

AzFの取り込みが最初のステップで確認されたため、アジド-EPOをBCN修飾PEGおよびLPGとインキュベートして、部位特異的バイオコンジュゲートを取得しました（図2B）。 アジド-EPO を LPG-BCN とインキュベートすると、非共役 EPO の予想分子量でより弱いバンド パターンが得られました。 さらに高分子量の汚れやバンドが見られ、ポリマーのカップリングが成功したことを示しています (図 2B、レーン 1)。 この仮定は、アンバー終止コドンでの終結によって生じる短縮型 EPO と LPG-BCN をインキュベートすることによって検証されます。 ここでは、LPG-BCN の末端生成物の上に追加のバンドは見られませんでした (レーン 3)。 LPG-EPO の糖消化によりスメアが低分子量にシフトし、グリコシル化 EPO が LPG-BCN にうまく結合したことが示されました (レーン 2)。

アジド-EPO と PEG-BCN のインキュベーションでも同様の結果が得られました。 ここでは、高分子量での定義されたバンドが見られ、PEG-BCN とアジド-EPO の結合が確認されています (レーン 5)。 再度、PNGase F 消化後、顕著なバンドはより低い見かけの分子量にシフトし、グリコシル化アジド EPO が PEG-BCN にうまく結合したことを示しました (レーン 6)。 LPG-BCN とは対照的に、PEG-BCN の末端生成物へのわずかに非特異的な結合がオートラジオグラフィーによって検出されます (レーン 7)。 これは、脱グリコシル化された EPO (アジド基なし) をポリマーとインキュベートするとさらに顕著になります (レーン 4 および 8)。 ここでは、変換された EPO に AzF が存在しないため、カップリングは期待されません。 したがって、オートラジオグラフでは、図 1 のレーン 5 に相当するバンド パターンが見えるはずです。 実際、LPG の存在下でも同じバンド パターンが見られます。 対照的に、PEGの存在下でわずかに追加のバンドが見えるのは、切断型EPOへのPEGのわずかな非特異的結合を示しています。 AzFが組み込まれていない完全長EPOへのPEG-BCNの同等の非特異的結合も検出されました(レーン10)。 AzFが組み込まれていない全長EPOへのLPG-BCNの非特異的結合は観察されなかった(レーン9)。 追加のコントロールにより、予想された結果が明らかになり（補足図3）、AzFの統合とその後の各ポリマーのカップリングが確認されました。 それにもかかわらず、細胞培養分析用に、LPG 結合 EPO と非結合 EPO の混合物が得られました。 オートラジオグラフィーに基づくと、サンプルの約 50 ～ 70% には LPG 結合 EPO が含まれていますが、残りの 30 ～ 50% は非共役 EPO で構成されています。 EPO への PEG の結合はほぼ 100% の効率をもたらしたため、細胞培養アッセイにおける PEG 結合 EPO の割合は約 90% であると推定されます。 残りの 10% は、非共役 EPO と非特異的に共役した PEG-EPO で構成されます。

個々の EPO 変異体の活性を測定するために、成長ホルモン依存性細胞株 (TF-1 細胞) を修飾および非修飾 EPO の存在下および非修飾下で培養しました (図 3 および 4)。 活性アッセイにより、EPO を含むすべてのサンプルが市販の EPO と同等の細胞の増殖をもたらすことが示されました。 PEG-EPO の添加後に最も高い効果が見られました (図 3)。 この効果は、未修飾の EPO および市販の PEG 化 EPO (Mircera®) と比較してさらに高かった。 予想通り、対照（テンプレート対照および終結産物なし）は、活性を示さないか、または限られた活性しか示さなかった（終結産物）。 興味深いことに、PEG修飾EPOと非修飾EPOは4日目までほぼ同等の増殖曲線を示しました。非修飾EPOの増殖曲線は4日後に最大​​に達しましたが、PEG修飾EPOのピークは5日後に計算されました。 さらに、PEG 修飾 EPO とインキュベートした細胞は、延長された増殖曲線を示しました。

PEG修飾および非修飾の無細胞合成EPOの細胞ベースの活性アッセイ。 PEG修飾EPO（実線）、非修飾EPO（破線）、終結産物（一点鎖線）を補充したTF-1細胞株の増殖曲線、無細胞テンプレート対照（NTC、破線）二点線）、市販の EPO（破線）、市販の Mircera®（灰色の破線）。 無細胞合成 EPO 変異体の濃度は、TCA 沈殿によって測定されました。 10 ng/mL の各サンプルを 24 ウェル プレートで培養した TF-1 細胞に添加しました。 細胞を6日間カウントした。 データは、二重に測定された 3 つの独立した実験の標準偏差として表示されます (n = 3)。

LPG修飾および非修飾の無細胞合成EPOの細胞ベースの活性アッセイ。 LPG修飾EPO（実線）、非修飾EPO（破線）、終結産物（一点鎖線）を補充したTF-1細胞株の増殖曲線、無細胞テンプレート対照（NTC、破線）二点線）、市販の EPO（破線）、市販の Mircera®（灰色の破線）。 無細胞合成 EPO 変異体の濃度は、TCA 沈殿によって測定されました。 10 ng/mL の各サンプルを 24 ウェル プレートで培養した TF-1 細胞に添加しました。 細胞を6日間カウントした。 データは、二重に測定された 3 つの独立した実験の標準偏差として表示されます (n = 3)。

同等の効果が、LPG-EPO および対応するコントロールの添加後に見られました (図 4)。 最も高い増殖速度は、市販の EPO を添加した後に測定され、最大細胞密度は 7 × 105 細胞/mL となりました。 ここでも、最大細胞密度 6.2 × 105 細胞/mL の LPG-EPO の効果は市販の EPO と同等でした。 驚くべきことに、LPG-EPOの添加後に計数された細胞の最大値は、4日目および5日目のPEG-EPOと一致しました。LPG-EPOの効果は、PEG-EPOの添加と比較してさらに高かった。 再度、無細胞合成非修飾 EPO を添加すると、4 日目に最大細胞密度が 5.5 × 105 細胞/mL となりました。

予想された結果がコントロールで検出されました。細胞は終結生成物と NTC の存在下で急速に死滅します。 追加のコントロールでは、細胞培養に対するポリマーの影響は明らかにされませんでした（補足図4）。

EPOの安定性に対する結合LPGおよびPEGの影響を、血清安定性試験によってさらに分析しました(図5)。 修飾および非修飾 EPO バリアントをヒト血清中で 24 時間インキュベートしました。 サンプルは所定の時点で収集されました。 タンパク質の完全性はオートラジオグラフィーによって分析されました。 非修飾 EPO (全長および非標準アミノ酸を含む) は、非グリコシル化 EPO と最大 3 部位でグリコシル化された追加の EPO からなる特徴的なバンド パターンを示しました。 PEG-EPO は、ポリマー結合タンパク質に対応する、EPO よりも高い分子量のバンドを 1 つだけ示しました。 非共役タンパク質は検出されませんでした。 ＬＰＧ－ＥＰＯは、ＰＥＧ－ＥＰＯのバンドの上に再びスミアを示した。 非共役 EPO のわずかなバンドが見えます。 すべてのバイオコンジュゲートがヒト血清中で 24 時間インキュベートした後でも同等のバンド パターンを示したため、PEG と LPG の結合は EPO の血清安定性に有意な影響を示さなかった。

修飾および非修飾 EPO の安定性分析。 未修飾の完全長 EPO、非標準アミノ酸 (ncaa) を含む未修飾 EPO、PEG 修飾および LPG 修飾 EPO をヒト血清中で最大 24 時間インキュベートしました。 その後、サンプルをアセトン沈殿させ、オートラジオグラフィーを伴う SDS-PAGE によって分析しました。 24 時間後でもバンド パターンに変化は見られず、EPO サンプルが安定していることを示しています。 トリミングされていないオートラジオグラフィー画像は補足情報に含まれています。

ポリ (エチレン グリコール) (PEG) は、安定性、溶解性、免疫原性などのタンパク質の特性を改善するための「ゴールド スタンダード」です。 過去 30 年間に、低分子量 (550 Da) から大きな直鎖および分岐ポリマー (> 8,000,000 Da) に至るまで、広範囲の異なる PEG 構造が製造されました 45。 1992 年には化粧品中に 7 種類の異なる PEG 構造しか検出されませんでしたが 46、この数は 2015 年には 340 以上の異なる PEG 構造に増加しました 47。PEG の頻繁な使用は、PEG の不活性で非免疫原性の挙動にも関連しています。 それにもかかわらず、最近の報告では、PEG化リポソーム、タンパク質の注射後、およびPEGを含む化粧品との接触後に、抗PEG抗体が発生する可能性があることが示されています。 特に、タンパク質に結合した複数の短い PEG 鎖 (< 10 kDa) は、抗 PEG 抗体を誘導する可能性が高くなります 50,51。 最近の研究では、PEG化EPO52の治療効果に対する既存の抗PEG IgMおよびIgG抗体の影響が分析されました。 この目的のために、PEG-EPO投与前に抗PEGモノクローナル抗体を事前に注射したマウスモデルを確立した。 その結果、肝臓および脾臓におけるPEG-EPOの蓄積により、新しい赤血球の産生を誘導するPEG-EPOの能力が抗PEG抗体によってブロックされた。 PEG-EPO の生物学的活性は、初期濃度を増加させることで回復しました。 したがって、PEG-EPO の適切な用量は、個々の患者における既存の抗 PEG 抗体の測定に応じて評価される必要があります。 あるいは、PEG と同様の機能を持つ新規生体分子が、抗 PEG 抗体に関する現在の問題を回避する可能性があります。

一方、ポリ(グリセロール)、ポリ(オキサゾリン)、ポリ(ヒドロキシプロピルメタクリレート)、ポリ(2-ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリ(N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド)、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(N 、N-ジメチルアクリルアミド）、およびポリ（N-アクリロイルモルホリン）は、PEG53、54の代わりに研究されています。 各ポリマーは、非免疫原性、高い親水性、優れた生体適合性などの独自の利点を示しますが、蓄積性、非生分解性、部分的に合成コストが高いなどの欠点もあります55。 したがって、個々のタンパク質の特性と人体への影響の可能性に関する情報を得るには、ポリマーを詳細に評価する必要があります。

直鎖ポリグリセロール (LPG) の構造的特徴により、タンパク質への結合の有望な候補となります。 Abu Lilaらは、PEG化リポソームとLPG化リポソームを比較した研究で、 PEG化リポソームとは対照的に、LPGによる修飾はシステムの生体内性能を高めることを観察しました。 LPG化リポソームは、薬学的活性に悪影響を与える可能性がある反復投与時のPEG化リポソームの限界である加速血液クリアランス（ABC）を誘導しませんでした56。

Imran Ul-haq らは、PEG と LPG を in vitro 設定と in vivo 設定で比較しました。 彼らは、同じサイズの分子を比較した場合、LPG の固有粘度が PEG より 25 倍小さいことを示しました。 この特性は、より高い濃度が必要な製剤では非常に重要です。 さらに、赤血球（RBC）凝集および溶血アッセイに基づく研究では、LPG は 10 mg/mL の濃度でも RBC 凝集を誘導しなかったのに対し、PEG はこの濃度で大規模な RBC 凝集を誘導したことが観察されました 57。 これは、より分子量の小さいPEGおよびLPG58でも以前に観察されています。

無細胞タンパク質合成は、タンパク質の安定性や完全性への影響、培養ヒト細胞への影響など、PEG および LPG ベースのポリマーの基本特性を分析するために選択されました。 無細胞タンパク質合成系における EPO の合成と修飾の成功は以前に示されました 36。 2018 年の研究とは対照的に、我々は現在、EPO の特性に対する結合ポリマーの影響を分析しています。 興味深いことに、両方のポリマーはカップリングプロセス後に異なる挙動を示しました。 ポリマーの結合後、高分子量への顕著な変化が SDS-PAGE で見られました。 実際、たとえLPG-BCNとPEG-BCNが10 kDaという同様の分子量を持っていたとしても、ゲル移動は両方のポリマー間で異なって見えました。 この効果は、PEG59 について前述したように、SDS-PAGE 内のポリマーの特異的な相互作用によって説明できます。 さらに、LPG-BCN および PEG-BCN をヒトインターロイキン 431 に結合させた後でも、同等の効果が見られました。 ゲル移動の変化に加えて、LPG と PEG のバイオコンジュゲーションでは異なるカップリング効率が示されました。 PEG-BCN のカップリング効率は 90 ～ 95%、LPG-BCN のカップリング効率は 50% と推定されます。 これらの違いは、特定のタンパク質とポリマーの相互作用プロファイルが原因で発生する可能性があります。 PEG-BCN の場合、正に荷電したリジンとアルギニンが記載されていますが、LPG はセリンとメチオニンのすぐ近くに見出されています 32。 EPO では、メチオニンやセリンと比較して、リジンとアルギニンの割合がはるかに高くなります。 独立して、カップリング効率は両方のポリマーにとって十分であり、オートラジオグラフィーによって特定のシグナルが測定されました。 その結果、細胞培養に対する非修飾および修飾 EPO の影響が決定されました。 細胞はEPO変異体の存在下でのみ増殖するため、増殖曲線は期待された結果を示しました。 それにもかかわらず、EPO バリアント間の違いは明らかでした。 最初の 3 日以内では、非修飾 EPO、PEG-EPO、LPG-EPO による刺激による細胞の増殖はほぼ同一でした。 4 日目以降、非修飾 EPO とインキュベートした細胞の増殖は停止しましたが、両方の修飾 EPO とインキュベートした細胞は増殖を続けました。 これは、ポリマー修飾 EPO の活性が持続していることを示しています。 これらの発見は、ポリマー結合型 EPO 変異体の記載されているプラ​​スの効果と一致しています 7,8。

安定性アッセイから得られたデータも以前の発見と一致しています。 以前の研究では、EPOを含む血清および血漿サンプルを収集し、これらのサンプルをさまざまな条件で14日間保存しました。 室温で保存したサンプルでも、14 日後には免疫反応性 EPO が含まれていました 60。

無細胞タンパク質合成はμLからリットルスケールで実行でき、EPOなどの薬学的に関連するタンパク質の合成は通常数時間以内に実行されるため、このシステムは、事前に結合したPEG代替品のスクリーニングに優れた選択肢を提供します。人間の EPO における定義された位置。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 (およびその補足情報ファイル) に含まれています。

ポリエチレングリコール）

直鎖ポリグリセロール

エリスロポエチン

銅触媒によるアルキンアジド付加環化反応

ひずみ促進アジド-アルキン付加環化

ビシクロ[6.1.0]非-4-イン

強化および改変された大腸菌チロシル-tRNA-シンテターゼ

P-アジド-1-フェニルアラニン

ヨトウガ・フルギペルダ

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Sf21 ライセートの調製に関して、著者らは D. Wenzel と Dipl に感謝したいと思います。 イング。 (FH) DA ヴュステンハーゲン (フラウンホーファー IZI-BB、ポツダム ゴルム、ドイツ)。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセス資金調達。 この研究は、科学・研究・文化省 (MWFK、ブランデンブルク、ドイツ)、プロジェクト PZ-Syn (プロジェクト番号 F241-03-FhG/005/001)、および連邦教育研究省 (BMBF、ドイツ)、プロジェクト CEFOX (031B0831)、およびプロジェクト Next-PEG (13XP5049A)。

これらの著者は同様に貢献しました: Paria Pouyan、Anne Zemella、Rainer Haag、Stefan Kubick。

ベルリン自由大学化学生化学研究所、Takustr. 3、14195、ベルリン、ドイツ

パリア・プーヤン & ライナー・ハーグ

フラウンホーファー細胞療法・免疫学研究所 (IZI)、生物分析およびバイオプロセス部門 (IZI-BB)、Am Mühlenberg 13、14476、ポツダム、ドイツ

アン・ゼメラ、ジェフリー・L・シュロスハウアー、ルーベン・M・ウォルター、ステファン・キュービック

ベルリン自由大学、化学・生化学研究所-生化学、Takustr. 6、14195、ベルリン、ドイツ

ジェフリー・L・シュロスハウアー & ステファン・キュービック

ベルリン工科大学バイオテクノロジー研究所、Gustav-Meyer-Allee 25、13355、ベルリン、ドイツ

ルーベン・M・ウォルター

健康科学学部、ブランデンブルク工科大学コトブス・ゼンフテンベルク学部、ブランデンブルク医科大学テオドール・フォンターネおよびポツダム大学（ドイツ、ポツダム）

ステファン・キュービック

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PP: 概念化、データキュレーション、形式的分析、調査、方法論、検証、視覚化、執筆。 AZ: 概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、検証、視覚化、執筆。 JLS: データのキュレーション、レビュー。 RMW：データキュレーション、レビュー、SK：概念化、資金獲得、プロジェクト管理、リソース、監督、検証、レビュー、編集、RH：概念化、資金獲得、プロジェクト管理、リソース、監督、検証、レビュー、編集

アン・ゼメラまたはライナー・ハーグへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

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受信日: 2023 年 1 月 25 日

受理日: 2023 年 4 月 13 日

公開日: 2023 年 4 月 19 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-33463-x

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