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Apr 23, 2023

モノクローナル抗体産生のためのハイブリドーマ技術を理解する

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ハイブリドーマ技術には、短命の抗体産生 B 細胞と不死化骨髄腫細胞の融合が含まれます。 得られた細胞株は、特定のモノクローナル抗体を際限なく供給します。1 この技術は、1975 年にノーベル賞受賞科学者のジョルジュ コーラーとセザール ミルスタインによって考案されました。

モノクローナル抗体

科学者は、単一の抗体産生細胞株をクローニングすることによってモノクローナル抗体を作成します。 ポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体は抗原に対して非常に特異的です。 無限に分裂できる骨髄腫細胞と、対象の標的に対する特異的抗体を産生する B 細胞を融合することにより、研究者はほぼ無制限の同一のモノクローナル抗体の供給源を入手できます。2

1986 年以来、腎移植拒絶反応に対するマウスモノクローナル抗体ムロモナブ CD3 を皮切りに、117 を超えるモノクローナル抗体が FDA に承認されています。3 マウスやヒトからの抗体に加えて、研究者は、以下の配列で構成されるキメラおよびヒト化モノクローナル抗体を作製しました。両方の種から。 これらのモノクローナル抗体は、マウス由来のタンパク質配列をヒト由来のタンパク質配列と置き換えることにより、ヒトで免疫反応を引き起こすリスクを軽減します。 4 科学者たちは、さまざまな方法を使用して、さまざまな目的のために他の哺乳動物からもモノクローナル抗体を作製しています。

ステップ 1: 予防接種

研究者は、哺乳動物、通常はマウスに標的抗原を注射し、免疫反応を刺激します。 抗原注射は、数週間にわたって連続して行われる場合があります。 次に、研究者はマウスの脾臓を採取して、目的の抗体を産生する B 細胞を取得します。1

ステップ 2: 細胞融合

研究者らは、細胞培養中で抗体産生B細胞と骨髄腫細胞を融合させた。 ポリエチレン グリコール (PEG) は両方の細胞の原形質膜の融合を促進し、2 つ以上の核を持つ単一のハイブリドーマ細胞を形成します。 あるいは、電気融合では、パルス電場を使用して細胞を結合することもできます。5

ステップ 3: ハイブリドーマ細胞の増殖

融合してハイブリドーマ細胞を形成する初期細胞は 1% 未満です。 培養中の未使用の B 細胞は自然に分裂を停止しますが、化学療法は融合していない骨髄腫細胞を破壊します。 研究者は、HAT (ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン) 培地を使用して、不死化モノクローナル抗体産生細胞株の選択的増殖を可能にします。 HAT 培地中のアミノプテリンはヌクレオチド合成を停止しますが、ヒポキサンチンとチミジンは、HGPRT (ヒポキサンチン-グアニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ) 酵素を保有する B 細胞などの細胞によって使用されます。 機能的な HGPRT 酵素を持つハイブリドーマ細胞は生存して増殖できますが、それを欠いている骨髄腫細胞は最終的に死にます。1

ステップ 4: スクリーニング

研究者は酵素免疫測定法 (ELISA) を使用して、目的のモノクローナル抗体についてハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることがよくあります。 間接 ELISA は、抗原を表面に固定化し、それをハイブリドーマ細胞上清とインキュベートすることにより、適切な特異性を備えた抗体を同定します。 研究者はまた、ウエスタンブロット、フローサイトメトリー、免疫沈降質量分析などの技術を使用して、ハイブリドーマ培養物をスクリーニングします。1

ステップ 5: ハイブリドーマの拡大

最終ステップでは、目的のハイブリドーマ細胞をクローニングして安定した細胞集団を取得し、培養物を増殖させて大量のモノクローナル抗体を収集します。 これは 2 つの方法のいずれかで実現できます。1

このテクノロジーには多くの利点があります。

ただし、このテクノロジーにはいくつかの制限もあります。1,7

診断アプリケーション

ハイブリドーマ技術によって産生される抗体は、その高い特異性により、以下を含む幅広い診断用途に使用できます。

免疫療法

モノクローナル抗体にはさまざまな FDA 承認の適応症があります (以下の表を参照)。3 一般的な適応症には次のようなものがあります。

モノクローナル抗体

抗体のサブタイプ

標的抗原

初のFDA承認適応症

承認年

レカネマブ

ヒト化 IgG1

アミロイドベータプロトフィブリル

アルツハイマー病

2023年

マルゲツキシマブ

キメラ IgG1

HER2

HER2+ 乳がん

2020年

トラスツズマブ

ヒト化 IgG1 ADC

HER2

HER2+ 乳がん

2019年

オマリズマブ

ヒト化 IgG1

IgE

喘息

2003年

アダリムマブ

ヒト IgG1

TNF

関節リウマチ

2002年

インフリキシマブ

キメラ IgG1

TNF

クローン病

1998年

バシリキシマブ

キメラ IgG1

IL-2R

腎移植拒絶反応の予防

1998年

パリビズマブ

ヒト化IgG1

RSウイルス

RSウイルス感染症の予防

1998年

リツキシマブ

キメラ IgG1

CD20

非ホジキンリンパ腫

1997年

参考文献

2.ミトラS、トマールPC。 ハイブリドーマ技術; 進歩、臨床的意義、将来の側面。 J Genet Eng Biotechnol. 2021;19(1):159。 土井:10.1186/s43141-021-00264-6

3. EU または米国で承認または規制審査中の抗体治療薬。 抗体協会。 2023 年 3 月にアクセス。

4. カステリ MS、マクゴニグル P、ホーンビー PJ。 モノクローナル抗体の薬理学と治療への応用。 薬理研究の視点。 2019;7(6):e00535。 土井:10.1002/prp2.535

5. Tabll A、Abbas AT、El-Kafrawy S、Wahid A. モノクローナル抗体: C 型肝炎ウイルスの免疫診断および免疫療法の原理と応用。 ワールドJヘパトール。 2015;7(22):2369-2383。 doi:10.4254/wjh.v7.i22.2369

6. Kohler G、Milstein C. あらかじめ定義された特異性の抗体を分泌する融合細胞の連続培養。 自然。 1975;256:495–497。 土井: 10.1038/256495a0

7. モラエス JZ、浜口 B、ブラッギオン C 他ハイブリドーマ技術: まだ役に立ちますか? Curr Res Immunol。 2021;2:32-40。 doi:10.1016/j.crimmu.2021.03.002

8. Sundarraj S、Rajagopal G、Sundaramahalingam B、他。 診断、予後および治療のための癌におけるタンパク質の検出方法。 タンパク質の検出。 インテックオープン; 2022.doi.org/10.5772/intechopen.101050

9. Mazzulli T. ウイルス、クラミジア、クラミドフィラ、およびマイコプラズマによる感染症の検査室診断。 小児感染症の原則と実践。 2008;1352-1368。 土井:10.1016/B978-0-7020-3468-8.50293-5

10. 疾病管理予防センター。 CDC イエローブック 2020: 海外旅行のための健康情報。 ニューヨーク：オックスフォード大学出版局。 2017年。

11.PKを排出する。 SARS-CoV-2 の迅速診断検査。 N 英語 J 医学 2022;386(3):264-272。 土井:10.1056/NEJMcp2117115