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May 18, 2023

エステルの合成と回収

Edizione di biologia della comunicazione

Communications Biology volume 6、記事番号: 306 (2023) この記事を引用

646 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

トキソプラズマ・ゴンディは、人間だけでなく家畜にも感染する蔓延している人獣共通感染症病原体です。 この寄生虫は、数種類の有核宿主細胞内で繁殖する優れた能力を備えているため、膜生合成のために内因性および宿主由来の栄養資源を調整して使用する必要があります。 ホスファチジルエタノールアミンは、T. gondii で 2 番目に一般的なグリセロリン脂質ですが、急性感染性の高速分裂タキゾイト段階におけるその要件がどのように満たされるのかは依然として謎のままです。 この研究により、寄生虫がエステル結合およびエーテル結合した PtdEtn の需要を満たすために、新たな合成および回収経路を展開していることが明らかになりました。 オーキシンを介したホスホエタノールアミンシチジリルトランスフェラーゼ（ECT）の枯渇は、浸潤と細胞分裂の障害によりタキゾイトに致死的な表現型を引き起こし、溶解サイクルにおけるCDP-エタノールアミン経路の重要な役割を明らかにした。 それに応じて、内膜複合体は、その長さ、寄生虫の幅、主要なリン脂質の減少と同時に破壊されているように見えました。 TgECT 変異体のリピドミクスと同位体分析を統合した結果、エステル PtdEtn の内因性合成と宿主細胞からのエーテル結合脂質の回収が明らかになりました。 簡単に言うと、この研究は、T. gondii がさまざまな手段を操作して、その de novo 合成の治療的関連性を特徴づけながら、異なる形態の PtdEtn を生成する方法を実証します。

原生動物門アピコンプレックスには、トキソプラズマ、プラスモディウム、アイメリア、クリプトスポリジウムなど、多くの一般的な細胞内病原体が含まれています。 この属で唯一既知の種であるトキソプラズマ ゴンディは、さまざまな脊椎動物の多くの種類の有核細胞に感染する驚くべき能力を持っています。 したがって、最も成功した病原体の 1 つとして認識されています。 T. gondii による宿主の自然感染は、汚染された食品中のオーシストまたはシストを摂取することによって始まります。 オーシストまたは嚢胞からそれぞれ放出されたスポロゾイトおよびブラディゾイト段階は、胃上皮に感染し、さらに感染性が高く、無差別で急速に分裂するタキゾイト段階に発展し、他の組織で増殖し、最終的には永続的な溶解サイクルによって壊死を引き起こします1,2。 物理化学的ストレスや免疫ストレスを受けると、一部のタキゾイトは被包ブラディゾイトに分化し、慢性感染を確立します。 宿主細胞内での細胞内複製のために、寄生虫はその合成および回収経路を介して十分な膜バイオマスを生産する必要があり、その多くは優れた抗寄生虫治療標的を与えます 3,4。

グリセロリン脂質は、T. gondii のタキゾイトの生体膜の主要成分を構成します 4,5,6,7,8。 ホスファチジルコリン (PtdCho)、ホスファチジルエタノールアミン (PtdEtn)、ホスファチジルスレオニン (PtdThr)、ホスファチジルセリン (PtdSer)、ホスファチジルイノシトール (PtdIns)、ホスファチジルグリセロール (PtdGro) およびホスファチジン酸塩 (PtdOH) が典型的なホスファチジンです。タキゾイトに存在し、最適な溶解サイクルに必要な脂質。 9、10、11、12。 多くのリン脂質は、寄生虫の複製における通常の役割に加えて、最近、カルシウムの恒常性とシグナル伝達の重要な役割を担っており、タキゾイトの滑走運動性、侵入および退出に寄与している7、12、13、14、15。 寄生虫は、宿主細胞から取得した前駆体を使用してリン脂質を合成できます5、7、9、10、11、12、16、17、18、19。 さらに、細胞外および/または細胞内環境から特定のリン脂質種/プローブを回収することができます12、18、20。

PtdEtn はタキゾイト中で 2 番目に一般的なリン脂質であり、エステルおよびエーテル結合型で存在します 5、6、7。 寄生虫ミトコンドリアおよび寄生虫胞胞に位置する異なる PtdSer デカルボキシラーゼ (PSD)、小胞体の CDP-エタノールアミン別名ケネディ経路、および原形質膜における P4-ATPase 媒介フリッピングを介するなど、いくつかの経路でエステル PtdEtn を生成できます 5,10。 20、21。 CDP-エタノールアミン経路による内因性合成には、タキゾイトによって生成できるジアシルグリセロール足場が必要です18。 T. gondii ではまだ研究されていませんが、エーテル結合 PtdEtn には、哺乳動物細胞内のアルキルグリセロンリン酸シンターゼによって生成されるアルキルグリセロール骨格が含まれています 22。 機能面では、エステル-PtdEtn の円錐形は膜の曲率に寄与し、出芽、融合、分裂現象を制御し、それによって膜-タンパク質相互作用を促進します 23。 一方、エーテル PtdEtn の形状により、ヘッドグループ間の分子間水素結合が強くなり、膜の流動性が低下します 22,24。

この研究では、トキソプラズマ タキゾイトの溶解周期におけるエステルおよびエーテル PtdEtn の生合成および生理学的関連性を調べました。 我々は、寄生虫のサイトゾル内でエタノールアミンキナーゼ由来のホスホエタノールアミンをCDP-エタノールアミンに変換するホスホエタノールアミンシチジリルトランスフェラーゼ（ECT）を研究しました。 私たちのデータは、ECTがヒト細胞におけるタキゾイトの無性生殖に不可欠であることを示しています。 突然変異誘発による条件付きの枯渇により、エステル PtdEtn 種の量と合成が損なわれますが、エーテル PtdEtn は影響を受けません。 同様に、細胞内寄生虫が宿主細胞からエーテル結合 PtdEtn を回収できることも発見しました。

私たちの以前の研究では、寄生虫ゲノム内に潜在的なアルキルグリセロンリン酸シンターゼを同定できなかったものの、タキゾイトに機能的な CDP-エタノールアミン経路が存在することが報告されています5。 以下の研究では、新規 PtdEtn 合成の最初と最後の酵素、つまりエタノールアミン キナーゼ (EK) とエタノールアミン ホスホトランスフェラーゼ 9,10 について説明しました。 今回、我々は、CDP-エタノールアミンを生成する基質としてホスホエタノールアミンとCTPを使用するECTタンパク質を同定した25。 モデル生物である出芽酵母、ホモ・サピエンス、ハツカネズミおよびブルーセイ・トリパノソーマのホモログと比較することにより、トキソプラズマゲノムに潜在的なECTが存在することがわかりました（TGGT1_310280、図1）。 約400残基を含み、別個のクレードを形成する哺乳類およびキネトプラスト類のECTとは異なり、アピコンプレックス類のホモログははるかに長く、独自の異なるクレードを形成します。 PfECT と EfECT はそれぞれ 573 残基と 665 残基をコードしますが、TgECT は 1128 アミノ酸を含みます。 アピコンプレックス型 ECT は、標準的な相同体と比較して、100 残基を超える異常な N 末端伸長を持っています。 TgECTは例外的に約500アミノ酸の長い伸長を持ち、その結果、非アピコンプレクサの対応物よりも3倍大きなタンパク質が得られます（図1a）。

a 代表的な寄生原生生物および哺乳類宿主からのエタノールアミンシチジリルトランスフェラーゼの一次構造と系統学的近接性。 Uniprot または NCBI データベースから取得したタンパク質配列を Clustal W によってアラインメントし、MEGA 11 ソフトウェア (最尤法、JTT マトリックス モデル) によって系統図を構築しました。 ECTの配置は補足図1で見ることができます。 b TgECTのシチジリルトランスフェラーゼドメインの三次元相同性モデル（右）とHsECTの結晶構造との重ね合わせ（灰色、PDB：3ELB、左）。 c smHAエピトープによるTgECTの3'ゲノムタグ付けを示すスキーム。 d ECT遺伝子座でのsmHAタグとDHFR-TS選択マーカーの組み込みを確認するゲノムPCR。 PCR1 および PCR2 はトランスジェニック遺伝子座をテストするために使用され、PCR3 は親株の対照として含まれました。 e トランスジェニック株におけるsmHAタグ付きTgECTの発現を示す免疫ブロット。 アスタリスク (*) は正しい TgECT-smHA バンド (180 kDa) を示します。 他の小さいサイズのバンドは、TgECT-smHA の分解生成物である可能性があります。 f タキゾイトにおける TgECT-smHA と TgALD の免疫蛍光共局在 (感染後 24 時間)。 寄生した培養物を、α-HA および α-TgALD 抗体を使用して標識しました。

TgECT は、他の生物の対応物と同様に、リンカー領域で区切られた約 100 ～ 150 残基の 2 つの直列シチジリルトランスフェラーゼ ドメインを保持しています。 これは、単一の CT ドメインのみを含む細菌の CTP: グリセロール-3-リン酸シチジリルトランスフェラーゼまたは真核生物の CTP: ホスホコリン シチジリルトランスフェラーゼ (CCT) とは対照的です。 典型的な ECT ドメインの配列アラインメントにより、保存された残基も特定されました (補足図 1)。 シチジリルトランスフェラーゼファミリーの特徴的なモチーフはすべて TgECT に存在します: HSGH および HVGH。 RTEGISTS モチーフ。 KWVDEVI および RVVDEVI 領域 (補足図 1)。 HsECT 構造 (PDB コード、3ELB) に基づく TgECT ドメインの相同性モデリングは、HSGH、HVGH、および RTEGISTS が触媒中心の形成に関与し、KWVDEVI および RVVDEVI が N 末端および C 末端 CT ドメインの二量体化を可能にすることを示唆しています。 (図1b)。 HsECT および PfECT の N 末端 CT ドメインはその触媒活性にとって重要であり 26,27 、これは TgECT にも当てはまると考えられます (図 1a)。

ホスホエタノールアミンを生成する CDP-エタノールアミン経路の最初のステップはサイトゾルで起こり 9、PtdEtn を合成する 3 番目/最後の反応は小胞体で起こります 10。 ここでは、CDP-エタノールアミン形成の細胞内位置を解読するために、ECTの局在を調べました。 我々は、3'ゲノムタグ付けによってC末端スパゲッティモンスター（10xHA）に融合したECTを発現するトランスジェニック寄生虫株を生成しました。 ピリメタミン耐性DHFR-TS発現カセット（選択マーカー）に隣接する5 'および3'相同配列を持つドナーアンプリコンを、Cas9をコードするCRISPR構築物および遺伝子特異的sgRNAとともにタキゾイトに同時トランスフェクトしました（図1c）。 薬剤耐性寄生虫を限界希釈法によってクローン化し、ゲノムPCRによって目的の遺伝子座への組み込みをスクリーニングしました（図1d）。 さらに、ウェスタンブロットによってタグ付けが成功したことを確認し、トランスジェニックではTgECT-smHAに対応する予想された180 kDaのバンドが示されましたが、親株では示されませんでした（図1e）。 免疫蛍光染色により、既知の細胞質マーカーであるアルドラーゼ（TgAld）28,29と共局在する寄生虫内のECT-smHAの点状分布が明らかになりました（図1f）。 溶解周期中の ECT の生理学的関連性を評価するために、CRISPR/Cas9 支援二重相同組換えを介してタキゾイトの遺伝子を削除することを試みました。 しかし、実行可能なノックアウト変異体を達成するための私たちの複数の実験は無駄であり、このタンパク質がタキゾイトの生存に不可欠であることを示唆しています。

次の研究では、インドール-3-酢酸 (IAA) とのインキュベーション時にタグ付きタンパク質をプロテアソーム分解に導くオーキシン誘導デグロンに基づいて TgECT の条件付き変異体を作成しました30。 ECT-3'UTR を切断するための Cas9 および sgRNA をコードする CRISPR/Cas9 コンストラクトを、タキゾイトの標的遺伝子座での相同性指向修復のためのアンプリコンと同時トランスフェクトしました。 ドナー配列には、3'挿入タグ付けおよびDHFR-TS選択マーカーのためのAID-3xHAモチーフに隣接する5'および3'相同アーム（それぞれ40 bp）が含まれていました（図2a）。 ゲノムの組み込みは、クロスオーバー特異的プライマーを使用したPCRスクリーニングによって検査され（図2a、b）、3'遺伝子のタグ付けが確認され、DNA配列決定によって検証されました。 TgECT-smHA（図1f）と一致して、AID-3xHAタグ付きECTは、別の細胞質マーカーであるTgHSP90と共局在する細胞質ゾルに存在しました31（図2c）。 免疫ブロットにより、IAAなしで培養したトランスジェニック株におけるAID-3xHAタグ付きECTに対応する〜180 kDaのタンパク質が明らかになりましたが、シグナルはIAA処理の1時間以内に急速に枯渇する可能性があります（図2d）。 IAAによるECTの急速な枯渇は、免疫蛍光アッセイによって確認されました（図2e、補足図2）。

a オーキシン誘導性デグロンおよび 3xHA による TgECT 遺伝子の CRISPR/Cas9 媒介 3' タグ付け。 pU6-Cas9-TgECTsgRNA 構築物 (Cas9 および ECT 特異的 sgRNA をコードする) をドナーアンプリコン (40 bp 5'/3' 相同アームが隣接する AID-3xHA-3'UTRGra1-DHFR-TS) でトランスフェクトしました。 RHΔku80-Δhxgprt-TIR1親株。 DHFR-TSを発現するピリメタミン耐性タキゾイトをクローニングし、PCRによってスクリーニングした。 最終的な TgECT-AID-3xHA 株は、インドール-3-酢酸 (IAA) による ECT の条件付きダウンレギュレーションを可能にしました。 b ECT遺伝子座におけるAID-3xHAの組み込みを解読するための組換え特異的スクリーニングPCR（aのプライマーを参照）。 PCR4/PCR5 および PCR6 は、それぞれトランスジェニック遺伝子座およびネイティブ遺伝子座の検査を示します。 c 変異体におけるTgECTとTgHSP90の共局在を確認する免疫蛍光画像。 d、e免疫ブロット法および免疫蛍光法によって示されたAID-3xHAタグ付きECTのIAA依存性発現。 寄生虫を、100μM IAAの非存在下または存在下で、示された期間培養した。 免疫染色は、α-HA および α-TgHSP90 (d) または α-HA および α-TgGAP45 (e) 抗体を使用して行われました。 各サンプルの等量のタンパク質をブロッティングのために 8% SDS-PAGE で分離し、続いて免疫染色を行いました。 f、g TgECT-AID-3xHAおよび親株（-/+IAA）によって生成されたプラーク。 クリスタル バイオレット染色画像は​​、コンフルエントな HFF 単層 (青色) 内に記載の菌株の連続溶解サイクルによって形成されたプラーク (不規則な白色領域) を明らかにします。 ImageJ によって定量化されたプラーク サイズは、任意単位 (au) で表示されます。 各株の 150 ～ 200 個のプラークをスコア化しました (n = 3 アッセイ; 平均 ± SE; ***p ≤ 0.001)。

条件付き変異体により、HFF 細胞における寄生虫の溶解サイクルに対する ECT の重要性を評価することができました。 我々は、T. gondii の全体的な成長適性を示すプラークアッセイを設定しました (図 2f、g)。 親株は培養中の IAA に関係なく正常な増殖を示し、オーキシンの非存在下でも TgECT-AID-3xHA 変異体も同様でした。 対照的に、宿主細胞単層にプラークが存在しないことから明らかなように、IAA による ECT の枯渇は寄生虫の増殖を阻止しました。 これらの結果は、ECT 遺伝子は欠失できないという前述の観察と共鳴し、T. gondii におけるその生理学的に重要な役割を確認しています。

次に、ECT枯渇タキゾイト培養物における致死表現型の原因を、複製、内生形成（細胞出芽）、出口、浸潤、滑走運動などの追加のアッセイによって調べました（図3）。 最初の 2 つの実験では、初期 (24 時間) および後期 (40 時間) の寄生培養に対応する時点を選択しました (図 3a、b)。 複製は、「液胞あたりの寄生虫」を数え、さまざまな数の子孫を含む液胞の割合を計算することによって定量化されました。 IAAの影響を受けなかった親株とは異なり、ECT変異体は、未処理サンプルと比較して、両方の時点でオーキシン処理培養物中に小さな液胞（1〜8個の寄生虫）の割合がはるかに高かった（図3a）。 16 を超える寄生虫を含む大きな液胞は、対照培養とは対照的に、ECT 枯渇条件下ではほとんど存在しませんでした。 一致して、内生形成の評価は、IAA処理TgECT-AID-3xHA変異体においてのみ娘細胞形成が強く損なわれていることを実証した（図3b）。

a、b TgECT-AID-3xHA および親株 (-/+IAA) の複製および出芽効率。 液胞内で複製する TgGAP45 染色タキゾイトをプロットして (寄生虫/液胞)、各株の増殖速度を反映しました (a)。 データポイントを含む簡略化された棒グラフについては、補足図6を参照してください。娘細胞の出芽は、子孫を持つタキゾイトを保持するTgIMC3陽性液胞の定量化に基づいて計算されました（b）。 棒グラフは、各サンプルの 400 ～ 500 個の液胞に基づいています。 c、d -/+ IAA条件におけるECT変異体と親株の退出率。 自然放出 (c) およびザプリナスト誘導放出 (d) については、200 個を超える寄生虫性空胞を含む 30 個のランダム フィールドをカウントすることによって結果が得られました。 e 示された株の侵入効率 (-/+IAA)。 表示されている棒グラフについて、合計 1000 を超えるイベントがスコア付けされました。 f タキゾイトの滑走運動性。 TgSAG1 で染色された寄生虫の運動性画分 (200 ～ 400 細胞、n = 4 アッセイ) およびトレイルの長さ (IAA 処理 TgECT-AID-3xHA (13 トレイル) を除く、1 グループあたり >60 トレイル) について分析しました。 g タキゾイトの収量 (-/+IAA)。 HFF 単層 (106 細胞) に指定の菌株 (MoI = 1) を感染させ、IAA の存在下または非存在下で 48 時間培養し、その後寄生虫を計数しました。 （a〜g）は、n = 3以上の実験からのデータを示しています（平均±SE; *p ≤ 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001）。

条件付き変異体は、タキゾイト複製の完了後の自然放出にも欠陥を示しました（図3c）。 我々は、観察された表現型が複製の遅れによるものであり、放出シグナル伝達の障害によるものではないかどうかを試験するために、ザプリナストに応答して誘導された放出をスコア化した。 この強力なホスホジエステラーゼ阻害剤は、cGMP シグナル伝達を活性化することにより、細胞内タキゾイトの早期排出を引き起こします 32,33。 実際、出口表現型はザプリナストによって回復され（図３ｄ）、これは統合的なシグナル伝達カスケードを示唆している。 特に、ECTを枯渇させた寄生虫は宿主細胞への侵入が非常に弱く（図3e）、この変異体が新たな感染を確立できないことを示唆しています。 侵入プロセスは滑走運動性によって駆動されるため、後者の表現型をアッセイしました（図3f）。 我々のデータは、IAAに曝露された変異体の運動性画分とトレイル長の顕著な低下を明らかにしたが、対照サンプルではそうではなかった。 観察された寄生虫の運動性、侵入および複製の欠陥は、オーキシンとインキュベートされた条件付き変異体の増殖の大幅な減少をもたらしました。 そのタキゾイト数（寄生虫収量）は、対照培養物と比較して、IAA処理により約90％減少しました（図3g）。

アピコンプレクサの運動性と運動依存性の侵入および退出イベントは、内膜複合体 (IMC) に埋め込まれたアクチン - ミオシン モーター (グリデオソーム) によって駆動されます 34。 娘細胞の染色（図3b）は、機能不全に陥っている細胞小器官を示しており、TgECT-AID-3xHA株のタキゾイトのTgGAP45（グリデオソーム機能に必須のよく特徴付けられたタンパク質）を視覚化することで調べました（図4a）。 ）。 変異体をIAAとともに24時間および48時間培養すると、親株と比較して明らかに狭くて短い寄生虫が得られました（図4a）。 私たちの観察を強化するために、TgGAP45 標識 IMC の長さと幅を測定しました。 IAA 治療後の両方の時点で、これら 2 つの次元の大幅な減少が記録されました。 オーキシンへの曝露により、IMCの長さは10％縮小しましたが（図4b）、タキゾイトの幅は25％減少しました（図4c）。 膜生合成におけるECTの寄与を推測して、ミクロネーム（MIC2）、細胞膜（SAG1）、アピコプラスト（フェレドキシン）、ミトコンドリア（HSP60）などの他の細胞小器官も免疫染色によって視覚化しました（補足図2）。 免疫染色された細胞小器官のいずれにも形態学的異常は明らかではありませんでした。 また、TgECT枯渇変異体（補足図3）の潜在的な細胞小器官欠陥を解読するために透過型電子顕微鏡も導入しました。これは、未処理の対照または親株（-/+IAA）と比較して明確な表現型を示さず、最初の結果を確認しました。間接免疫蛍光アッセイによる所見。

a TgECT-AID-3xHA株のタキゾイトを培養し(-/+IAA)、続いてTgGAP45の免疫染色を行った。 核はDAPIによって視覚化されました。 b、c オーキシンの存在下または非存在下で24時間および48時間培養した後のトランスジェニック株および親株のIMCの長さとタキゾイトの幅。それぞれ4つのタキゾイトを含む30個の寄生虫空胞の画像をImageJで分析し、示されたパラメーターを計算しました。 (n = 3 アッセイ、平均 ± SE、***p ≤ 0.001)。

PtdEtn合成におけるECTの推定上の役割を考慮して、TgECT-AID-3xHAおよび親株のリピドーム分析を実行しました（図5）。 総脂質を寄生虫から単離し、HPLC-MS によって分離して分析しました。 親株および未処理の変異体対照と比較して、ECT枯渇株のリン脂質含有量が約50％減少していることが観察されました（図5a）。 IAA処理変異体のすべての主要なリン脂質クラスの有意な減少が見られたが、親株では明らかな変化は見られなかった(図5b)。 ECT が枯渇すると、示された脂質の存在量は 30 ～ 50% 急減しました。 また、エステルおよびエーテル結合 PtdEtn のレベルも測定しました (図 5c)。 親株の -/+ IAA 培養物では何も変化しませんでした。 変異体におけるECTのノックダウンは、エステル-PtdEtnの減少を引き起こしましたが、エーテル-脂質の減少は引き起こしませんでした（図5c）。 したがって、エステル対エーテル-PtdEtn の比は、未処理培養物の 2.6:1 から ECT 枯渇変異体では 1.1:1 に変化しました。

a TgECT-AID-3xHA と親株のリン脂質含量の比較。 寄生虫を培養し (-/+IAA)、その後リピドーム分析を行った (n = 4 アッセイ)。 IAA処理サンプル中の各リン脂質の相対存在量を、未処理の対照培養物(-IAA、100%)と比較して示します。 b 特定の菌株のタキゾイトにおける標準リン脂質クラスの相対存在量 (-/+IAA)。 c 変異体および親タキゾイトのエステル結合およびエーテル結合 PtdEtn プールの変化。 (a〜c) のデータは、SE を使用した平均値を示しています (n = 4 アッセイ)。 統計的有意性は、+IAA サンプルと -IAA サンプルを比較することによって計算されました (**p ≤ 0.01; ***p ≤ 0.001)。

次に、存在量に関係なく、すべての検出可能なリン脂質種の変化の大きさを火山プロットとしてプロットし、IAAによるECTの損失時の倍率変化対統計的有意性を示しました（図6a、b）。 親株の脂質種はいずれも、2 倍以上の閾値を超える影響を受けませんでした（p 値 ≤ 0.01）（図 6a）。 一方、TgECT-AID-3xHA株は、PtdCho、PtdEtn、PtdIns、PtdSer、PtdThr、lyso-PtdCho、およびlyso-PtdInsに対応するいくつかの脂質種の実質的な制御を示しました（図6b、補足図4〜5）。 ）。 下方制御されたエステルリン脂質の中で、PtdEtn、PtdSer、およびPtdThr種が最も顕著でした（図6b）。 他のいくつか、すなわち、C36:1、C38:4、C40:5 PtdEtn、C42:5 PtdSer、C36:4、C38:1 PtdCho、および C20:4 lyso-PtdIn がアップレギュレートされました。 興味深いことに、PtdEtnおよびPtdChoに単独で属するエーテル脂質は、変異体において上方制御されるか、または変化しなかった(図6b、7a)。

a IAA 曝露時の個々のリン脂質種の変化を示す、親株と TgECT-AID-3xHA (下) 株のボルケーノ プロット。 定義された変化倍数の閾値 (≥2x) および誤検出率補正 p 値 (≤0.01) を使用して、大幅に変化した脂質を特定しました (n = 4 アッセイ)。 個々の種を表すさまざまなサイズの円が、豊富にスケールされています。 指定された閾値を超えるものはリン脂質のクラスに応じて色付けされ、その他のものは灰色で表示されます。 b (a) から選択された脂質種の変化を示すヒートマップ。 接頭文字「A」は、PtdCho および PtdEtn のエーテル形式を示します。 リピドミクス データは Excel シートで入手できます (補足データシート 1 ～ 2)。

a エステル結合およびエーテル結合した PtdEtn 種の相対存在量は、IAA による TgECT-AID-3xHA の処理により大幅に変化しました (図 6)。 b それぞれ[13C2]-エタノールアミンおよび宿主由来[13C2]-PtdEtnによる細胞外および細胞内TgECT-AID-3xHA変異体タキゾイト（-/+IAA）の安定同位体標識のスキーム。 後者のアッセイでは、HFF を [13C2]-エタノールアミン中で培養して PtdEtn を標識し、その後タキゾイトを増殖させて [13C2]-PtdEtn の回収をテストしました。 精製された寄生虫のエステルおよびエーテル PtdEtn 種への [13C2] の組み込みは、リピドミクス分析によって判断されました。 c、d (b)に記載されている、細胞外および細胞内タキゾイトのエステルおよびエーテル結合PtdEtn種における[13C2]-エタノールアミンの濃縮。 (a、c、d) のデータは、SE による平均を示します (a、n = 4 アッセイ、c、d、n = 5 アッセイ)。

リン脂質の連動した合成は、リン脂質の共制御のパターンを見つける動機となった。 ECT の喪失により、いくつかの種、特に PtdSer、PtdThr、および PtdEtn が共有する種が変化しました。 C34:2、C38:6、C38:7、C40:7 PtdSer および C38:6、C38:7 PtdThr は PtdEtn 種の傾向と一致し (補足​​図 4)、塩基交換 PSS および PTS 酵素による合成を示唆しています。 T.ゴンディ7で。 一般的な PtdEtn および PtdCho 種はかろうじて存在し (図 6b)、脂質メチルトランスフェラーゼの欠如を裏付けています 5。 同様に、合成の主権的経路から予想されるように、PtdEtn 種と PtdIns の相関関係は見られませんでした 12,25。 驚くべきことに、PtdCho (36:4、38:1)、PtdEtn (36:1、38:4、40:4、40:5)、および PtdSer (42:5) のいくつかの種が、ECT 欠損変異体で誘導されました (補足図 3b)、カウンターバランス機構を示しています。 しかし、指定された PtdEtn 種はいずれも、細胞外タキゾイトまたは事前に標識された宿主細胞で増殖したタキゾイトでは 13C2 標識されませんでした (図 7b、c、以下を参照)。 したがって、このようなエステル-PtdEtn 種は PSD によって形成される可能性があります 10、21。

エステル型とは異なり、エーテル PtdEtn 種は増加するか、影響を受けませんでした（図 7a）。このため、T. gondii におけるエーテル PtdEtn 合成の酵素を探索する必要がありました。 上で述べたように、私たちのバイオインフォマティクス分析では、寄生虫のゲノムに適切な候補が見つかりませんでした。 したがって、我々は、ケネディ経路がエステル結合 PtdEtn を提供し、エーテル脂質の生成が寄生虫環境に依存するという仮説を立てました。 この前提をテストするために、同位体標識（13C2-エタノールアミン）とその後のリピドーム分析を実行しました。これにより、寄生虫によって合成されたPtdEtn種と宿主細胞から回収されたPtdEtn種を区別することができました（図7b）。 以前に報告された PtdIns12 の 13C6-myo-イノシトール標識と同様に、13C2-エタノールアミンで標識された宿主を含まない寄生虫を分析して、内因的に生成された PtdEtn を識別しました。 同時に、事前に標識した宿主細胞で培養したタキゾイトを展開して、サルベージ経路の発生を推定しました。

細胞外寄生虫のリピドーム分析により、C34:1 (>5 倍)、C34:2 (約 11 倍)、C36:2 (約 10 倍)、C38:4 などのいくつかのエステル PtdEtn 種における 13C2-エタノールアミンの濃縮が明らかになりました。 （〜6x）およびC40：5（〜6x）（図7c）、機能的なCDP-エタノールアミン経路の存在が確認されました5、10。 IAA媒介ECT枯渇は、C34:1、C34:2、およびC36:2種の同位体標識を損ない、これらの含有量の観察された減少と一致しました（図7a）。 対照的に、C38:4およびC40:5 PtdEtnの13C2標識は、それらのレベルが乱れていないまたは増加しているのと一致して（図7a）、IAAの影響を受けませんでした（図7c）。 13C2-エタノールアミン標識宿主細胞で増殖したタキゾイトは、エステル-PtdEtn種のいずれにおいても同位体濃縮を示さず、これらの脂質の回収を排除した（図7c）。 逆に、細胞内で増殖したエステル-PtdEtn種（A34：2、A36：5）では13C2が豊富（〜4〜5倍）であるが、宿主のない寄生虫では反対の現象が観察されました（図7d）。 他の脂質種 (A38:5、A38:6、A40:6) は両方の設定 (約 2 ～ 3x) で同等に標識され、予想どおり、ECT の枯渇時にエーテル PtdEtn の 13C2 標識に変化は見られませんでした。 このデータは、寄生虫が宿主細胞からエーテル結合 PtdEtn 種を回収する一方で、エステル PtdEtn 種は主に CDP エタノールアミン経路を使用して新たに合成されることを意味しています。

アピコンプレクサ寄生虫の細胞内寄生の代謝基盤を理解することは、病原体宿主研究の中心となってきました。 過去 30 年にわたり、トキソプラズマ ゴンディは、培養が比較的容易であり、ゲノム操作や変異体の表現型解析のための高度なツールにより、アピコンプレクサの生物学を発見するためのモデル寄生虫に進化しました。 活発に研究されているにもかかわらず、アピコンプレクサにおける脂質生合成、輸送、サルベージ、センシングおよびシグナル伝達は依然として十分に評価されていない。 ホスホエタノールアミンシチジリルトランスフェラーゼ（ECT）を探索したこの研究により、T.ゴンディのタキゾイトがエステル結合およびエーテル結合したPtdEtn種に対する必要性を満たすために異なる経路を展開していることが判明した（図8）。 前者の脂質はケネディ経路を通じて生成されますが、後者のタイプは宿主細胞から回収されます。 ECT は、溶解サイクル中の寄生虫の侵入と複製を促進する必須タンパク質です。 これらの特徴と哺乳動物相同体からの系統的分岐により、TgECT は急性トキソプラズマ症の治療阻害のための優れた薬物標的となっています。

このモデルは、この研究とここで引用した以前の研究に基づいています。 タキゾイトは複数のルートを展開して PtdEtn を生成します。 エステル-PtdEtn の需要は、主に CDP-エタノールアミンおよび PSD1mt 経路を介して満たされます。 前者はER内でエステル-PtdEtnの新規合成を促進し、後者はミトコンドリア内でPtdSerを脱炭酸することによってPtdEtnを生成します。 寄生虫の細胞質ゾルに位置する ECT は、CDP-エタノールアミン経路の 2 番目の律速酵素です。 これは寄生虫の生存に不可欠であり、IAA による TgECT-AID-3xHA 変異体における条件付きノックダウンは、多くの PtdEtn、PtdSer、および PtdThr 種の減少につながります。 後の 2 つの脂質は、ER 内の PSS および PTS 酵素によって駆動される塩基交換反応を介して PtdEtn から作られる可能性があります。 ECT の損失は内膜複合体を損傷し、滑走運動、浸潤、細胞分裂の欠陥の根底にある可能性があります。 寄生虫のエーテル結合 PtdEtn の必要性は、宿主細胞からのサルベージによって満たされます。 細胞内タキゾイトがPSD1pv由来のエステル-PtdEtnを取り込むかどうかは不明である。 寄生虫の表面に存在する P4-ATPase は、エーテル結合およびエステル結合した PtdEtn の反転に役割を果たしている可能性があります。

私たちの研究は、エステル-PtdEtnの生成におけるCDP-エタノールアミン経路の役割を示唆しています。 ECT 変異体では、多くのエステル PtdEtn 種のレベルが減少しました。 他の特定の脂質が乱れなく上方制御されている量は、追加の経路の機能的存在と寄与を示しています。 Ester-PtdEtn は PSD1mt および PSD1pv によって生成できます (図 8)10,21。 さらに、少なくとも細胞外タキゾイトは PtdEtn を回収することができ 15,20 、細胞内では PSD1pv の触媒作用により寄生胞胞内で作られた PtdSer 由来の PtdEtn を獲得できると考えられます。 最後に、宿主の小胞体と液胞膜上に動員されたミトコンドリアは、哺乳動物細胞における PtdSer と PtdEtn 合成の主要な部位であり、これらの脂質の追加供給源として機能する可能性があります。 興味深いことに、PSD1mt ノックアウトタキゾイトは長期培養でも生存し、CDP-エタノールアミン経路の上方制御を示します 10 が、ECT は溶解サイクルに必須であるため、その逆は当てはまらないようです。 我々は、異なる反応が個別のエステル-PtdEtn種の合成を促進し、ケネディ経路によってコードされるエステル-PtdEtn種の合成は他の手段では平衡化できず、ECT変異体における致死的な表現型につながると提案する。

Kennedy 経路の生理学的関連性は、T. brucei や P. bergei などの他の寄生原生生物でも研究されています 37,38。 これらの寄生虫は機能的な PSD 酵素を保有しているにもかかわらず、基礎となる酵素はこれらの寄生虫にとって必須であると報告されています。 TbECT の枯渇は寄生虫の増殖を阻害し、T. brucei における PtdEtn 含有量の減少および異常な形態と相関していました 37。 これらの発見は、T. gondii の ECT 枯渇タキゾイトの表現型を反映しています。 TgECT の条件的喪失により、リン脂質組成の調節不全 (おそらく PtdEtn 種) に起因すると考えられる異常な IMC と同時に、寄生虫の侵入と複製が無効になりました。 寄生虫の運動性を駆動する運動複合体であるグリデオソームを宿主とする IMC は、溶解サイクルにとって重要です。 TgECT の喪失によるグリデオソームの混乱は、グリデオソームの機能不全をもたらし、タキゾイトの運動性、侵入、および退出の障害につながる可能性があります。 さらに、哺乳動物細胞で説明されているように、変異体におけるエステルとエーテル結合 PtdEtn の比率が歪んでいると、膜の流動性と細胞質分裂に影響を与える可能性があります 23。

我々のデータは、PtdEtnが、それぞれPSSタンパク質およびPTSタンパク質によって触媒されるエタノールアミンからセリンまたはスレオニンへの交換反応を介してPtdSerおよびPtdThrを合成するためのドナーとして機能することも示唆しています（図8）。 特に、いくつかの PtdEtn 種 (36:1、38:4、40:4、40:5) は、ECT の枯渇によって影響を受けないか、さらには上昇しました。 これらはおそらく PtdSer の脱炭酸によって作られており、PSD1mt および PSD1pv 変異体のリピドーム分析に価値があります。 PtdCho および PtdIns 種の調節と PtdEtn 種の調節には明らかな類似点はなく、前者の 2 つのリン脂質の独立した合成経路に影響を与えました 4、5、12。 重要なことに、この研究は、細胞内寄生虫による宿主由来のエーテル-PtdEtn種の回収を明らかにしています（図8）。 タキゾイトはエステル-PtdEtn18を作るためのジアシルグリセロールを生成することが知られているが、エーテル-PtdEtnのアルキルグリセロール足場を生成するための真正のアルキルグリセロンリン酸シンターゼは寄生虫ゲノム中には見つからなかった。 タキゾイトにおけるエーテル結合脂質の存在は謎に満ちています。 これらは、哺乳動物細胞において「酸化還元」効果を有することが報告されている 22,24。 これらを欠いた特定の培養細胞は、酸化的損傷に対してより感受性が高くなります。 同様に、これらの脂質の酸化促進機能についても説明されています 39。 今後の研究は、T.ゴンディのタキゾイトにおけるエーテル脂質の回収機構と機能的重要性の詳細な解明に​​焦点を当てる必要がある。

結論として、この研究は、TgECT がエステル PtdEtn の合成に寄与する重要な酵素であることを実証しています。 その条件的枯渇により、タキゾイトにおける膜の生合成、複製、および侵入が損なわれます。 我々は、PtdEtn を生成するための内因性合成、相互変換、およびサルベージ経路の連携を明らかにします。 特に、このデータは、寄生虫によるこれまで知られていなかった宿主由来のエーテル結合 PtdEtn 種の除去を示し、T. gondii における PtdEtn 合成の治療標的化に対する健全な基礎を提供するものである。

T. gondii の RHΔku80Δhxgprt-TIR1 株、AID-3xHA タギング用の pLinker-AID-3xHA-HXGPRT プラスミド 40、抗 TgALD および抗 TgMIC2 抗体は、David Sibley (ワシントン大学、セントルイス、アメリカ合衆国）。 TgGAP45、TgHSP90、TgIMC3、および TgFerredoxin に結合する他の一次抗体は、Dominique Soldati-Favre (スイス、ジュネーブ大学)、Sergio O. Angel (IIB-INTECH、アルゼンチン)、Marc-Jan Gubbels (ボストン大学、米国) によって提供されました。とフランク・ゼーバー氏（ベルリンのロベルト・コッホ研究所）。 TgHSP60 に対する一次抗体とブタ抗 Tg 血清は、国家農業微生物学重点研究所 (中国、武漢) で製造されました。 血球凝集素 (HA) エピトープおよび TgSAG1 に対する他の一次抗体は、それぞれ Sigma-Aldrich (ドイツ) および ThermoFisher Scientific (ドイツ) から入手しました。 免疫染色用の二次抗体 (Alexa488、Alexa594、IRDye 680RD、800CW) およびオリゴヌクレオチド (補足表 1) は、Life Technologies (ドイツ) から購入しました。 細胞培養試薬はPAN Biotech (ドイツ)から購入しました。 他の標準化学物質は、Sigma-Aldrich および Carl Roth (ドイツ) から供給されました。 クローニング用の試薬キットは、Analytik Jena および Life Technologies (ドイツ) から入手しました。 脂質標準は Avanti Polar Lipids (米国) によって提供されました。

ヒト包皮線維芽細胞 (HFF) を宿主細胞として使用して、T. gondii のタキゾイトを増殖させました。 細胞をトリプシン処理 (0.25% トリプシン-EDTA) によって回収し、個々のアッセイの要件に従ってフラスコ、ディッシュ、またはカバースリップに播種しました。 タキゾイトを維持するために、コンフルエントな単層を隔日感染させた。 培養は、グルコース (4.5 g/L)、ウシ胎児血清 (10%、PAN Biotech、ドイツ)、グルタミン (2 mM)、ピルビン酸ナトリウム (1 mM)、ペニシリン (100%) を添加した DMEM (ダルベッコ改変イーグル培地) 中で実施しました。 U/mL)、ストレプトマイシン (100 μg/mL)、および最小イーグル非必須アミノ酸 (各 100 μM) を 37 °C、5% CO2 の加湿インキュベーター内で測定しました。 ほとんどのアッセイでは、タキゾイトは、23 ゲージおよび 27 ゲージの注射器でこすったり噴出したりすることによって、後期の寄生培養培養物から放出されました。 細胞外寄生虫は下流アッセイに直接利用されました。

タキゾイト (約 107) をフィルター滅菌サイトミックス (120 mM KCl、0.15 mM CaCl2、10 mM K2HPO4/KH2PO4、25 mM HEPES、2 mM EGTA、新鮮な 5 mM グルタチオンを添加した 5 mM MgCl2 および5 mM ATP; pH 7.6)。 次いで、トランスフェクトされたプラスミドによってコードされる選択マーカーに対応する薬剤を用いて寄生虫を選択した。 薬剤耐性トランスジェニック寄生虫は、HFF 細胞を含む 96 ウェル プレートで限界希釈することによってクローン化されました。 所望の遺伝子操作を行った個々のクローンは、PCR および免疫染色アッセイのスクリーニングによって同定されました。 TgECT-AID-3xHA株を生成するために、ECT遺伝子座でのクロスオーバーのための短い(40 bp)相同アームが隣接するAID-3xHA-TgGRA1-3'UTRおよびDHFR-TS選択マーカーを含むドナーアンプリコンを同時トランスフェクトしました。 RHΔku80Δhxgprt-TIR1 株の CRISPR-Cas9 構築物を使用します。 TgECT-smHA株を生成するために、Cas9およびTgECT特異的sgRNAを発現するプラスミド構築物を、10xHAおよびDHFR-TS発現カセットを含むPCRアンプリコンでRHΔku80-hxgprt-株にトランスフェクトした。 変異型寄生虫は 1 μM ピリメタミンによって選択され、ECT の AID-3xHA または smHA タグ付けについて PCR スクリーニングされました。

以前に報告されたように、アッセイは実行されました41。 HFF 細胞を播種し、24 ウェル プレートに配置したカバーガラス上でコンフルエントになるまで増殖させました。 新たに放出された寄生虫を使用して、HFF 単層を感染させました。 寄生した宿主細胞をＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで１５分間固定し、続いて０．１Ｍグリシン／ＰＢＳで中和した。 サンプルを0.2% Triton-X100/PBS (20分)で透過処理し、0.2% Triton-X100/PBSで調製した2% BSA (20分)でブロックしました。 最終的に細胞を対応する一次染色（α-HA、1:3000; α-TgGAP45、1:5000; α-TgIMC3、1:2000; α-TgALD、1:1000; α-TgFerredoxin、1:500; TgSAG1）で染色しました。 、１：１０００；抗Ｔｇブタ血清、１：１０００、ＴｇＭＩＣ２、１：１０００）および二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５９４、１：３０００）をそれぞれ１時間。 異なる処理ステップの間にサンプルを PBS で洗浄し、イメージング用に DAPI-Fluoromount G (Carl-Zeiss、ドイツ) にマウントしました。

以前に報告されているように、表現型アッセイは、注射器で放出された新鮮な寄生虫を使用して設定されました7、12、32。 簡単に言うと、プラークアッセイは、コンフルエントなHFF単層を200個の寄生虫/ウェルで感染させ、続いて7日間平静にインキュベート(0.1%エタノール中-/+100μM IAA)することによって6ウェルプレートで実施した。 未処理のサンプルにはキャリア溶媒が含まれていました。 培養物を冷メタノールで固定し（15分間）、クリスタルバイオレットで染色しました（15分間）。 プラークは、ImageJ スイート (NIH、Bethesda) を使用して定量化されました。 複製および内因性アッセイでは、カバースリップ上のコンフルエントな HFF 単層を感染させ (MoI:1、24 時間、40 時間)、続いて固定し、α-TgIMC3 および α-TgGAP45 抗体で染色しました。 細胞分裂は、寄生虫の液胞内で複製する寄生虫を数えることによって評価されました。 滑走運動性を測定するために、タキゾイトを IAA とともに 48 時間前培養しました (該当する場合)。 その後、Ca2+ を含まないハンクス平衡塩類溶液 (-/+ IAA) に懸濁した 4 × 105 個の寄生虫を定着させ (400 g、5 分、室温)、続いて 0.01 %BSA。 寄生虫と痕跡を視覚化するために、サンプルをα-TgSAG1 および Alexa488 抗体で染色しました。 運動性画分は顕微鏡で直接推定され、トレイルの長さはImageJソフトウェアを使用して定量化されました。

浸潤試験では、タキゾイトを 100 μM IAA またはキャリア溶媒中で 40 時間前培養し、カバースリップ上の宿主細胞に感染させるために使用しました (MoI:10、1 時間)。 他の場所で報告されているように、サンプルは固定、中和、染色されました 32。 非侵入（細胞外）寄生虫は、培養物の界面活性剤透過処理の前に、TgSAG1 について免疫染色されました。 サンプルを PBS で洗浄し、透過処理し、TgGAP45 タンパク質で染色して、侵入した (細胞内) タキゾイトを視覚化しました。 培養物を PBS で洗浄し、二次抗体 (Alexa488、Alexa594) で標識し、蛍光イメージング用に DAPI-Fluoromount G (Carl-Zeiss、ドイツ) にマウントしました。 侵入した寄生虫の割合 (侵入効率) を 2 色の寄生虫によってカウントしました。 自然排出アッセイでは、カバースリップ上で培養した HFF に寄生虫 (MoI:2、40 時間/64 時間、-/+ 100 μM IAA) を感染させ、続いて 2 段階染色 (浸潤アッセイと同様) を行って、破壊された HFF と無傷の HFF を区別しました。液胞32．

単一の自然退出実験では、合計 PV を決定するために退出前 (40 時間) と、残りの PV をスコア化するために退出後 (64 時間) の 2 つの時点で寄生虫の空胞をチェックする必要がありました。 40 時間の時点では、タキゾイトは退出しようとしていますが、まだ退出していませんでしたが、64 時間の時点では、親株のすべての寄生虫が退出していました。 退出率 (%) は、[無傷の PV の数 (40 時間) – 無傷の PV の数 (64 時間)]/合計 PV の数 (40 時間) × 100 として計算されました。誘導された退出の場合、寄生した培養物 (MoI: 1、24時間）を500μMのザプリナストで処理した（30分間）。 ここでは、非誘導条件下で脱出が起こらないことを保証するために、より早い時点(24時間感染、8〜16個の寄生虫/液胞)を選択した。 寄生虫の収量を定量化するために、培養皿 (3 cm) 内の宿主細胞 (106 個) をタキゾイト (106 個の寄生虫、MoI: 1) に感染させ、48 時間のシリンジ放出 (27 G) 後に子孫を数えました。

寄生虫収量アッセイに基づいて、サンプル収集に 48 時間の感染を選択しました。 以前に報告されたように、脂質は精製タキゾイトの新鮮なペレットから抽出されました (1 × 107/サンプル)。 単離した脂質を窒素流下で乾燥し、100 μL のクロロホルムとメタノール (1:1) に溶解し、そのうちの 10 μL を 60 °C に維持した Acquity BEH C18 UPLC カラム (2.1 × 100 mm、1.7 μm) に注入しました。 。 脂質種の分離は、両方とも 2.5 mM 酢酸アンモニウムを含む水中のメタノールとアセトニトリルの勾配を使用して達成されました。 流速 600 µL/min での勾配溶出は次のようにプログラムされました (分単位の時間、% B): (0、12.5)、(7.5、100)、(14、100)、(14.1、87.5) 、（17、87.5）。 流出液を Sciex X500R QToF 装置で加熱エレクトロスプレー イオン化にかけました。 データ依存の MS2 スペクトルは、蓄積時間 150 ms、衝突エネルギー 35 V、CE 拡散 15 V で収集されました (MS1 範囲 400 ～ 1050 amu、前駆体 > 600 amu、MS2 範囲 50 ～ 1050 amu)。 データ処理SciexOS の Analytics モジュールと MSDial42 を使用して実行されました。

アッセイは、[13C6]-myo-イノシトール 12 について前述したように実行されました。 [13C2]-エタノールアミン (Sigma-Aldrich、ドイツ) で細胞外寄生虫を標識するために、TgECT-AID-3xHA 変異体を 100 μM IAA なしまたはありで 48 時間前培養し、その後シリンジで放出し、PBS で洗浄し、5 μm で濾過しました。ゴミを取り除くフィルター。 次に、寄生虫 (1 × 107 匹) を 0.5 mM [13C2]-エタノールアミンを含む 100 μL DMEM (-/+ IAA) に懸濁し、リピドーム分析前に 37 °C で 6 時間インキュベートしました。 [13C2]-PtdEtn を保有する HFF 内の寄生虫の細胞内標識のために、T-175 フラスコ内の宿主細胞を 25 μM [13C2]-エタノールアミン中でコンフルエントになるまで増殖させました。 培養物をＰＢＳで洗浄して培地から過剰な同位体を除去し、５０倍過剰（１．２５ｍＭ）のエタノールアミンの存在下で寄生虫を感染させて、増殖するタキゾイトの内因的に産生されたＰｔｄＥｔｎへの細胞内蓄積同位体の混入を排除した。 子孫寄生虫は、エステル結合およびエーテル結合した PtdEtn 種について分析されました。

T75 フラスコ内の HFF 単層をタキゾイト (MoI = 2) で 48 時間感染させました。 寄生細胞を切除し、PBSで洗浄し、2.5% (v/v) グルタルアルデヒド/PBS (0.1 M、pH 7.2) 中で4℃で一晩固定しました。 サンプルを PBS で洗浄し (3 回、室温で 30 分間)、1% (w/v) 四酸化オスミウムで 2 時間後固定し、PBS で 30 分間再洗浄し、段階的な一連のアセトン濃度で脱水しました。 脱水ブロックを徐々に浸透させ、Spurr 樹脂 (SPI Chem、米国) に埋め込み、65 °C で 48 時間重合させました。 サンプルはダイヤモンドナイフで極薄切片（厚さ60～70 nm）にスライスされ、2％酢酸ウラニルで染色され、透過型電子顕微鏡（H-7650、日立、日本）を使用して80 kVで画像化されました。

他に指定しない限り、グラフに示されるデータは、代表的な寄生虫クローンを使用した 3 回の実験からの SE を含む平均値として表示されます。 統計分析は、GraphPad Prism プログラム (カリフォルニア州、米国) を使用して実行されました。 有意性は、等分散による対応のない両側 t 検定によって検定されました (*p ≤ 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001)。 多重比較検定の誤検出率を導入しました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究中に生成および/または分析されたデータは、主要論文 (図 1 ～ 8) および補足ファイル (補足図 1 ～ 6、表 1) で提供されます。 元のゲル、ブロット、プラークの画像を補足図 6 に示します。グラフと画像のソース データは補足 Excel ファイル (補足データ 1 ～ 2) にあります。 合理的な要求に応じて、すべてのリソースも著者から入手できます。

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技術的支援については Grit Meusel (ベルリンのフンボルト大学)、電子顕微鏡研究の支援については Limin He (華中農業大学、武漢) に感謝します。 また、示されたリソースを共有してくれたトキソプラズマ コミュニティにも感謝します。 この研究は主に、ハイゼンベルク プログラム (GU1100/16) およびニシット グプタに授与されたプロジェクト助成金 (GU1100/17) を通じてドイツ研究財団 (DFG) によって後援されました。 中国国立自然科学財団（NSFC、31961133032、共同代表者：Nishith Gupta）から追加の資金がBang Shenに提供され、DBT–Wellcome Trust（India Alliance、IA/S/19/1/504263）からNishith Guptaに追加資金が提供された。 。 我々はまた、バン・シェン氏のグプタ研究所への短期訪問を支援する、国際協力を開始するためのDFGの資金提供（GU1100/15）にも感謝する。 ベルリンのフンボルト大学におけるシャオハン・リャン氏の共同研究は、中独研究促進センター（CDZ）がニシット・グプタ氏とバン・シェン氏に寄付した学者流動プログラム（M0074）によって後援された。 資金提供者は、この研究の設計、データ収集、分析、準備、または出版の決定において何の役割も果たしていませんでした。 この出版物のデータは主にベルリンのフンボルト大学 (HUB) で生成されました。 この記事の費用を賄うための HUB Open Access Publication Fund のご支援に感謝いたします。

Projekt DEAL によって実現および組織されたオープンアクセス資金調達。

Bingjian Ren、Xiaohan Liang の著者も同様に貢献しました。

ドイツ、ベルリンのフンボルト大学生命科学部分子寄生虫学教室

ビンジャン・レン & ニシス・グプタ

中国、武漢の華中農業大学農業微生物学国家重点研究所

シャオハン・リャン、バン・シェン、ニシス・グプタ

アバンス応用科学大学、ブレダ、オランダ、生命科学・技術学部、生命科学における分析技術研究グループ

ジョス・F・ブラウワーズ

細胞内寄生虫教育研究研究所 (iPEARL)、ビルラ工科大学生物科学部、ピラニ (BITS-P)、ハイデラバード、インド

ウィー・セーブ・クロス・ミロン＆ニシス・グプタ

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NG はプロジェクトの概念化と監督を行いました。 BR、XL、RCM は実験を行いました。 BR、XL、NG はデータを分析し、論文の草稿を作成しました。 JB はリピドミクス分析を実行しました。 NG と BS が資金を獲得し、管理しました。 著者全員が論文をレビュー、編集、承認しました。

バン・シェンまたはニシス・グプタへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。 NG はジャーナル Communications Biology の編集委員ですが、この論文の編集レビューや出版の決定には関与していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Hayley (E) Bullen と他の匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: George Inglis。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Ren、B.、Liang、X.、Brouwers、JF 他。 細胞内原虫病原体トキソプラズマ・ゴンディにおけるエステル結合およびエーテル結合ホスファチジルエタノールアミンの合成と回収。 Commun Biol 6、306 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04664-x

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受信日: 2022 年 9 月 25 日

受理日: 2023 年 3 月 6 日

公開日: 2023 年 3 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04664-x

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